組織因子相關微粒在血栓模型中的相關研究

陳洪昌

組織因子相關微粒(tissue factor-bearing microparticles，TF-MPs)在許多疾病的血栓形成過程中發揮著重要功能。目前已知，TF-MPs具有促進凝血與血栓形成等多種生物學活性，可介導很多疾病的凝血機制紊亂，研究TF-MPs的功能有助于深化對凝血機制障礙的認識，并為凝血功能障礙調控提供潛在的干預目標[1]。

通過對大鼠血栓模型中組織因子相關微粒的數目變化及陽性表達情況的分析，探索組織因子相關微粒對凝血級聯反應的影響關系，為血栓患者的早期預防和治療血栓、預測預后提供新的思路。現在就TF-MPs與大鼠血栓模型的影響分析予以綜述。

1 組織因子相關微粒(TF-MPs)

1.1 TF-MPs的來源 微粒(microparticles MPs)是細胞膜重塑后從受刺激細胞或凋亡細胞中釋放出的片段。在細胞受到刺激或者是細胞在凋亡時，細胞膜的不對稱性遭到破壞，使細胞膜外層的磷脂酰絲氨酸暴露，這些磷脂酰絲氨酸帶負電荷，進而細胞骨架及蛋白構架發生該變，最終，小囊泡從細胞膜脫落形成MPS[2]。通常MPS指的就是位于0.1～1 μm 的細胞膜碎片暴露出的磷脂酰絲氨酸。在微粒的表面，出現了血栓調節蛋白、組織因子途徑物、或蛋白質C可能提示著微粒MP指導的抗凝血途徑開始。然而，脂多糖治療會促進組織因子的表達，在組織因子和促凝血酶原激酶的刺激下，位于單核細胞和衍生的微粒MP表面的血栓調節蛋白的活性是極強的[3，4]。有大量研究顯示，當單核細胞、內皮細胞、血小板等受到刺激時，能表達釋放出含有組織因子的微粒，這些微粒有明確的TF相關促凝血活性。當血液中表達循環TF的微粒水平升高時，血液也表現出高凝狀態，由此可以推斷，通過檢測大鼠血栓模型中的循環TF微粒水平，研究其血栓形成的特點，可為血栓患者的早期預防和治療血栓、預測預后提供新的思路。

1.2 TF-MPs的定義 當MPs從細胞膜上脫落后，在受到脂多糖刺激后，單核細胞和衍生的微粒MP表面的血栓調節蛋白的活性是極強的，這些單核細胞脫落出的高表達TF的MPs[5]。這類高表達 TF 的 MPs，稱為 TF-MPs。

1.3 TF-MP的生物學效應 在血管內皮損傷后，會刺激凝血級聯反應的放大效應，組織因子在止血和血栓形成中起到加速放大的作用。在血漿中，組織因子以多種形式存在，其中就包括微粒和交替拼接而成的組織因子，而以微粒形式存在的就是組織因子相關微粒TF-MPs。當細胞受到刺激或者是凋亡時，TF-MPs大量釋放入血，推測就是TF-MPs促進了凝血級聯反應的發展。

在一些凝血功能障礙相關疾病中，TF-MPs在血漿中的數目及表達提高，例如敗血癥、動脈粥樣硬化、鐮刀形細胞貧血和癌癥。一份研究顯示，通過提取心臟外科患者的心包積液中的TF-MPs，將其注入大鼠模型中而促進了大鼠靜脈血栓的形成。在健康大鼠體內，造血細胞衍生的TF-MPs可增加大鼠提睪肌微循環的血栓形成。在腫瘤大鼠模型中，組織因子抗原與腫瘤大小密切相關，增高的腫瘤衍生的微粒水平與升高的凝血-抗凝血混合物水平密切相關。這些研究強有力地證實了TF-MPs在許多疾病中促進了血栓的形成。

活化的TF-MPs為凝血級聯系統中的獨特酶復合體提供了一個額外的促凝血磷脂表面。他們的催化性是依靠促凝血的負離子氨基磷脂、磷脂酰絲氨酸，在細胞膜重構后異位到血漿外的小葉。在實驗研究中發現，TF存在于正常血管的血液循環中，因此，有學者推測TF-MPs調控著凝血的級聯反應，在未受刺激時，TF-MPs處于休眠狀態，從而不會產生血栓，而且其濃度很低，不會對抗組織因子途徑抑制物;而受到刺激時(如血管受損)，大量的TF-MPs高表達于血循環中，參與凝血的激活[6]。

2 血栓模型

2.1 血栓模型動物的選擇 血栓動物模型是研究血栓發病機制及凝血級聯反應的基本實驗條件。在文獻報道中，約有8種動物用來制備血栓模型，而最常見的是用大鼠、兔、犬、豬來制備血栓動物模型。對于研究血栓動物中TF-MPs的變化，采用大鼠作為模型動物最佳，因為大鼠血栓模型最為經濟、常用，也適用于對干擾因素對抗血栓機制的研究。兔模血栓模型多用于研究血栓后的靜脈壁組織和細胞的病理學改變;犬模血栓模型常用于血管介入溶栓及區栓的相關研究;豬模血栓模型多用于觀察血管壁的組織學變化，造價最為昂貴。所以，對于研究TF-MPs在血栓動物模型中的變化及相關影響因素，最宜選擇大鼠作為造模對象。[7]

2.2 血栓動物模型的制備 目前，建立靜脈血栓動物模型的方法有如下幾種方法:①機械性損傷法。②電流損傷法。③結扎法。④光化學法。⑤創傷性肢體深靜脈血栓形成法。⑥化學藥物致血栓形成法。目前在研究TF-MPs中大鼠血栓模型的制備中，多采用化學藥物致血栓形成法，也有Falati[8]用光化學法制備模型，他用激光損傷大鼠的提睪肌動脈制備模型，激光刺激內皮細胞產生的TF最少，可避免內皮下暴露的TF干擾，但是血栓模型的成功率較化學藥物法低。

用化學藥物法制備血栓模型，最常用的是角叉菜膠(Ca)在大鼠皮下注射角叉菜膠后，多數大鼠尾尖部于3～14 h會出現暗紅色血栓區，逐漸向尾根部擴大，48～72 h會發紺變為黑色，而后變干變細，最終脫落。如果對角叉菜膠誘導的大鼠血栓模型成功率不滿意，還可以采用聯合應用角叉菜膠Ca與細菌內毒素(LPS)建造大鼠血栓模型。在大鼠腹腔注射Ca，16 h后再靜脈注射LPS，經試驗證明，造模后的大鼠尾部均形成了穩定的血栓[9]。通過在建模后觀察尾部血栓不同時間的情況，測定外周血中的化驗指標，可以得出血栓與凝血指標的相互變化。

在以往的敗血癥動物模型中，組織因子的表達促進了血管內的凝血及擴散。在循環血液當中，單核細胞是組織因子的主要來源。事實上，在人類毒血癥患者中，磷酯酰絲氨酸(LPS)刺激單核細胞誘導組織因子mRNA和蛋白質表達在人類毒素血癥模型中。另外，我們已經知道在造血細胞中降低組織因子的表達與在內毒素血癥的大鼠模型中降低凝血-抗凝血物水平密切相關。因此，用內毒素構建的大鼠血栓模型，更有益于研究TF-MPs在大鼠血液中變化情況。

3 TF-MPs的檢測

3.1 TF-MPs的檢測方式 血漿的組織因子水平可用多種方式檢測，其中包括酶聯免疫吸附實驗(ELISA)，流式細胞學計數，阻抗實驗和激活實驗。組織因子水平已經在健康人體中發現，這些研究結果的發現是由于用了不同的抗組織因子抗體和高水平的研究儀器，酶聯免疫吸附實驗可以檢測組織因子的水平，能被用于測量因子十(FXa)在血漿中產生。然而，最近的研究發現這項實驗不能測量血漿中激活的組織因子，因為觀察到FXa的產生不能被活性部位滅活的FV11a所抑制。用一種二者擇一的方法分離血漿中的微粒，并且測量它們的促凝活性。用一種稱作1B10的特異抗體捕獲的微粒收集這種微粒。或是用超速離心的方法分離這種微粒。在這些研究中，抑制性抗人類組織因子抗體存在與否的情況下，通過兩步發色激活分析法測量促凝活性。

3.2 TF-MPs的提取 在大鼠(2～3月大)腹膜腔內注射細菌內毒素(LPS)(7.5 mg/Kg)和角叉菜膠Ca后制備血栓大鼠模型。在藥物注射6 h后，從靜脈腔內抽取全血并注入0.38%的檸檬酸鈉。大鼠血漿以4000轉超速離心15 min，兩步法離心分離乏血小板血漿(PFP)，此血漿平均分為50微升后，在-80攝氏度下冷凍。

3.3 TF-MPs的檢測 提取好的乏血小板血漿(PFP)，20℃下離心l5 min獲取微粒碎片，棄去225 μl上清液，加入225 μl緩沖液(NaCl 140 mmol/L，KCl4.5 mmol/L，MgCl21 mmo1/L，CaCl22.5 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，pH7.4，0.2 m 濾膜過濾)，再次離心;棄去 225 μl上清液，加 75 μl緩沖液，重懸。將100 μl富含微粒的懸液按每份標本5 μl進行檢測，加35 μl緩沖液和5 μl牛血清白蛋白(BSA)稀釋，室溫孵育15 min。然后加入2O0 μl緩沖液再次離心。棄去200 μl上清液，加入200 μl緩沖液和100 μl計數微球，重懸，再次制成微粒懸液。然后用流式細胞儀進行計數分析，得到數據。根據側向光散射(Ssc)和前向光散射(Fsc)散點圖設定標準檢測微球門，應用7.2 μm和1.0 μm的微球當做內參照的檢測微粒，把1.O μm微粒用來設門，7.2 μm乳膠微球用來定量，以結合Annexin V和結合TF的抗體定量來定義表達TF的微粒。

4 TF-MPs與大鼠血栓模型對血栓疾病研究的展望

4.1 組織因子相關微粒在復雜的血栓形成中起著作用，并且與多種疾病有關，其中包括敗血癥和癌癥。大鼠作為一個最普通的動物實驗用于活的機體實驗。從以往的研究中，我們看到組織因子陽性微粒和內毒素血癥大鼠模型凝血-抗凝血物間有線性回歸關系，以前的研究結果顯示出人類組織因子抗原水平有相同的相關性。這些研究數據強有力的指出在內毒素血癥和癌癥大鼠模型中組織因子陽性微粒激活了促凝作用。

4.2 在以往的研究中，選擇素類和TF-MPs的促血栓作用是緊密聯系的。在內皮細胞損傷后，大量TF-MPs和白細胞團進入血栓中，這個過程P選擇蛋白(由血小板或內皮細胞表層擠出的一種粘附分子)是必須存在的。血小板選凝素糖蛋白配體1(PSGL-1)和血小板P選擇蛋白的相互作用被證明是在血栓邊緣的TF活性集聚的必要因素。在白細胞性血栓相互作用之前，造血細胞衍生的TF蓄積在形成血栓時與MPS積聚的動力學相關聯。在A型血友病的大鼠模型中，可溶性的P選擇蛋白被證明是促進白細胞衍生的TF-MPs脫落，它很可能來自于單核細胞。MPS的血漿水平隨著年齡的增長而增長，但在PSGL-1老鼠模型中是例外的，這說明了PSGL-1途徑的作用。此外，在設計大鼠模型中，達到了幾倍高度的血漿P選擇蛋白濃度，從而證明了不尋常的促凝血能力和突出的循環性白細胞衍生MPS包含的TF。P-選擇蛋白所引發的其他機制可能有助于增加血栓形成傾向。經證明，P-選擇蛋白趨向于轉移到來自單核細胞衍生的MPs分類的TF，或者是運輸到一個功能性的血小板實體。P選擇蛋白同樣會促進由單核細胞和TF表達的磷脂酰絲氨酸暴露[10]。

4.3 TF-MPs通過P選擇蛋白交互作用的補充作用，可能通過誘導纖維蛋白形成穩定的血栓。因為PSGL-1的相互作用通常能調停不穩定的轉換，附加的細胞黏合素能夠促進血栓的穩定作用。在缺血淤滯的血管中，TF-MPs在血栓形成過程中起著決定性作用。淤滯會局限吸收來的MPS，在設計的大鼠模型中表現出高水平的白細胞衍生的MPS，并且將其提呈給缺血部位。P選擇蛋白在內皮細胞促成MPS募集增強反應中起正調節作用，這導致在深靜脈中可看到的大量血栓。靜脈血栓栓塞疾病的患者中，內皮細胞，血小板和白細胞明顯的活動性可能證明通過檢測TF-MPs、P選擇蛋白的表達和血小板白細胞的集聚是有意義的[11]。

5 總結

近年來，越來越多的研究著重于TF-MPs在心血管疾病、腫瘤、炎癥及血栓類等疾病中的臨床應用，結果發現TF-MPs水平增高及MPs相關TF活性增高對血栓形成及疾病的進展密切相關。目前，通過對大鼠血栓模型進行干預，研究其血漿中的組織因子數量及活性變化與大鼠血栓情況的關系，可以為血栓類疾病的發展及預后提供參考，可為血栓患者的治療提供新的思路。

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