結核患者的結核分枝桿菌檢驗和分型

梁漢彰

結核患者的結核分枝桿菌檢驗和分型

梁漢彰

目的 探討結核患者的結核分枝桿菌檢驗和分型。方法 采用瓊脂糖凝膠的電泳和PCR技術, 選取200株結核分枝桿菌六個能夠變化的重復點進行檢測, 使用Version3.0及Gel-Proanalyzer3.0軟件對檢測的結果做一個基因型的分析, 同時分析結核分枝桿菌分型與基因間的關系。結果 這200株臨床分離的株全部被鑒定是結核的分枝桿菌；VNTR顯示結核桿菌株在不同的位點中具有多種形式的DNA指紋圖譜。結論 應用分子檢測法, 相比常規性方法, 它具有全信息化、可以重復以及操作簡單等優點。

結核患者；Version3.0軟件；基因分析；檢驗；分型

目前, 絕大多數肺結核患者就診于各級綜合性的醫院,怎樣才能夠有效地提高這些醫院對診治肺結核發現水平, 這已經成為我國醫院所面臨的一個非常迫切的事項, 只有提高了醫院的肺結核的發現率,才能夠有效地達到該病早期的治療, 早康復, 減少該病的傳染［1,2］。對此, 本文立足結核分枝桿菌的檢驗和分型理論, 結核相關前沿性信息, 來探討結核患者的結核分枝桿菌檢驗和分型。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院結核病防治部門從2010年11月-2012年11月間所接診結核患者的200株結核分枝桿菌,透過臨床上對分離株實施有效的分析。

1.2 方法 實驗室應用的試劑。在對結核患者的結核分枝桿菌檢驗和分型時要應用GoldViewTMDNA染料、TaqDNA聚合酶以及dNTP, 準備PCR材料［3］。

實驗室所應用的儀器。這些實驗儀器包括DNA的自動擴增儀、菌體培養箱、生物型的安全柜、恒壓恒流的電泳儀以及凝膠成像的系統［4］。

1.3 統計學方法 在本文中, 筆者所采用的相關數據均用(x-±s) 表示, 同時使用SPSS10.0軟件實施統計學處理, 同時為加強可信度, 本文中每組之間的數據的比較也使用t來進行檢驗, 文中的實驗數據都為平均值。P＜0.05為差異具有統計學上意義。

2 結果

2.1 在對這200株結核分枝桿菌實施監測的結果。運用TCH與PNB對這些200株進行實驗, 同時通過在菌體培養基中出現的問題對這些非結核性的分枝桿菌、結核的分枝桿菌進行詳細的分析, 獲得最終結果為：這200株臨床分離株全部被鑒定為結核的分枝桿菌。

2.2 在對這200株結核分枝桿菌進行VNTR的結果。在本院權威專家實施研究后, 作者進一步選擇了10個基因點進行研究, 對這些結核桿菌實施相關性的檢測, 同時用H37RV作了進一步的數據對照。在此實驗中可知在同一位點的擴增片段中的大小是不一樣的的, 結核桿菌株在不同的位點中具有多種形式的DNA指紋圖譜。

2.3 藥敏性的結果。在藥敏性的檢測中, 發現如下結果：完全敏感的結核分枝桿菌有160株, 占到總數的80%；產生耐藥性的結核分枝桿菌有40株, 占到總數的20%。

3 討論

隨著居民的物質生活水平得到顯著提高, 各種疾病也開始侵蝕國民的身體, 結核病已成為一種常見傳染性疾病, 它是一種慢性的呼吸道的傳染病, 也是當前一個非常突出的一個公共衛生問題, 現今在我國, 有結核菌感染者有4億人左右, 活動性肺結核病人有600萬左右, 結核已經成為當前社會一種嚴重威脅人類身體健康的傳染病。

如今, 生物工程發展迅速, 帶動了相關醫療技術的進步,臨床上我們運用可變數目的串聯重新分型技術可以有效的對結核患者的結核分支桿菌進行檢驗和分型, 相比常規性方法,它具有全信息化、可以重復以及操作簡單等優點。由于可以運用計算機進行分析, 可以大量的輸入樣本數據信息, 這樣得到的數據比較可靠。

臨床上, 除了應用分子技術進行檢驗外, 還有涂片法、分離培養法、快速結核分枝桿菌藥敏試驗等。

涂片法。涂片法一般讓涂抹的面積保持均勻的涂膜厚度,應用萋尼的染色抗酸進行染色,同時要求每一個涂片最小檢測200個油鏡視野。金胺石炭酸的染色法中的熒光染色最少要有檢測的20個視野, 這種檢測方法相比前一種方法的陽性的檢出率高, 但在特異性上沒有抗酸染色法優。

分離培養法。結核桿菌在培養基的培養方式常用的有幾種：一是利用雞蛋作為原料的培養基, 一般是運用羅氏的培養基。二是運用瓊脂作為原料的培養基。三是選擇性的培養基, 它可以與一些非選擇性的培養基一起應用, 選擇性的培養基的L-JGrugt 含有奈丁酸、青霉素, 同時培養基中包括林可霉素、放線酮及綦啶酸。四是液體培養基。

快速結核的分枝桿菌藥敏性試驗。操作方法一般在選用的結核桿菌的培養基中加進一些利福平藥物、熒光指示劑以及異煙肼藥物。培養基中的熒光一般在有氧的情形下會淬滅,一旦細菌存活下來實施代謝活動, 就會消耗培養基中的氧氣,熒光又會復發。應用365的紫外線燈下有沒有熒光來判斷耐藥或者敏感。這是由于熒蟲酶的基因進入培養基中的結核桿菌的嗜菌體, 嗜菌體在侵染存活的結核桿菌就會發出熒光。這些菌體在于一定濃度的藥物相互作用后, 如果這些菌體存活下來就會侵染嗜菌體, 觀測到有熒光的就是耐藥, 沒有熒光的就是敏感菌。

在一般分型中, 用RFLP技術實施結核菌的分型。臨床上,運用結核的分支桿菌插進序列IS6100的片段作為探針, 這樣就能夠運用結核桿菌DNA實施鑒定、分型, IS6100的片段一般僅存在結核分支桿菌中的復合基因組, 利用PVU-Ⅱ進行切割, 并用245BP的探針實施雜交, 這樣就能夠出現9～24條帶,能夠用在流行病學的分析, 例如在菌株, 結核分枝桿菌的標準菌株是H37RV和減毒性的結核分枝桿菌是H37RA。測定菌株經改良鑼氏培養基培養, 并鑒定為結核分枝桿菌。

對于結核病的管理工作也是一項非常重大環節, 在以上的預防措施的基礎上, 建立有效完善的可疑的肺結核者相關處理指引和報告制度。醫護人員一旦發現可疑的肺結核者后,就需要進行正確有效地進行現場隔離可疑的肺結核者的這些緊急的操作措施, 在依據可疑的肺結核者的具體情況決定采取何種藥物、治療干預措施。在此基礎上, 做好相關報告、登記程序, 并對肺結核患者身體狀況進行追蹤工作。

［1］ 蔣毅,張麗水,趙秀芹, 等. MLVA技術用于福建105株結核分枝桿菌基因分型的初步研究.中國人獸共患病學報.2007,17(03)：173-175.

［2］ 吳長東,米利古,龔天美, 等. RD105缺失基因檢測法用于結核分枝桿菌新疆“北京家族”臨床分離株的鑒定.中國病原生物學雜志.2010,15(03):183-184.

［3］ Borna Muller,Lin-Mari de Klerk-Lorist,Marijke M.Henton,et al.Mixed infections of Corynebacterium pseudotuberculosis and non-tuberculous mycobacteria in South African antelopes presenting with tuberculosis-like lesions.Veterinary Microbiology .2011,15(06)：73-75.

［4］ D.J.Stewart,J.A.Vaughan,P.L.Stiles,et al.A long-term bacteriological and immunological study in Holstein-Friesian cattle experimentally infected with Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis and necropsy culture results for Holstein-Friesian cattle, Merino sheep and Angora goats.Veterinary Microbiology .2007,18(02):283-284.

518081 深圳市鹽田區人民醫院檢驗科(深圳市第七人民醫院)