屎腸球菌冷凍干燥保護劑篩選及穩定性比較研究

彭虹旎，梁 莉，陳西廣

(1.中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島 266003；2.青島康地恩生物科技有限公司技術中心，山東 青島 266101)

屎腸球菌屬腸球菌屬，是乳酸菌類益生菌的一種，能調整單胃動物腸道菌群，抑制腸道內致病菌的過度繁殖。屎腸球菌在動物微生態制劑及食品添加劑方面有廣泛的應用，作為動物微生態的常用益生菌株，可單獨使用或與其他益生菌復配，用于調節動物腸道菌群，提高免疫力及改善生長性能[1-2]。

乳酸菌作為發酵劑或微生態制劑進行產業化開發時，需采用有利于菌體活性和貯存穩定性的生產與保存工藝，使活菌量在干燥和后續保存中都盡可能維持高水平，冷凍干燥法在菌體長期保存方面具有明顯優勢，且固體產品更易儲運和銷售應用。同時，產業化的工藝開發必須兼顧技術性和經濟性[3]。已往國內外對乳酸菌凍干工藝及存活率的研究中，對不同種類乳酸菌的凍干保護劑組成、凍干速率、預凍條件等內容都有涉及，其中保護劑包括蛋白質類、多糖類、小分子糖類、醇類和維生素類，其中被廣泛認可的保護劑常用主要成分包括脫脂乳、蔗糖、海藻糖等[4-6]，每種物質使用量10g/L至150g/L不等，在單一保護劑中甚至可達到250g/L[7]；其次使用較多的成分如谷氨酸鈉、甘油、VC等[8-10]，每種物質使用量5g/L至50g/L不等。在不同的實驗中，不同的乳酸菌凍干存活率介于6%[13]至93.05%[10]之間。如Volkert等[11]比較氣冷式冷凍法(air freezing)、噴淋凍結法(spray freezing)法等方法對鼠李糖乳桿菌活性和細胞膜完整性的影響，發現用20g/100mL脫脂乳作為保護劑時每種方法的凍干存活率都較高。另外，Schwab等[12]通過測定膜流動性和膜側壓，發現蔗糖、果寡糖和脫脂乳都可以明顯提高生長對數期羅伊氏乳桿菌的凍干存活率。Schoug等[13]通過響應面法評價不同的蔗糖濃度、細胞密度和冷凍速率對一株棒狀乳桿菌凍干存活率的影響，結果不同條件下這株棒狀乳桿菌的凍干存活率從低于6%到高于70%不等，他認為各種因素對該菌的存活率都有影響，但最重要的影響因素是冷凍速率，最佳速率應是2.8℃/min。在乳酸菌的保存研究方面，Miyamoto-Shinohara等[14]通過對凍干并真空保存于安瓶的不同種類革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌存放20a后活性的比較，發現細菌在凍干后的存活率與安瓶密封時的真空度有關，每種細菌凍干后的良好保存都有賴于高度的干燥和在高真空度下密封。其中嗜酸乳桿菌和屎腸球菌在凍干后存活率分別為62.5%和85.2%，它們的年存活率近96%。

屎腸球菌作為乳酸菌類益生菌中的一種，在微生態產品中的應用效果同樣受活菌量、貯存穩定性的影響。本實驗擬對屎腸球菌采用冷凍干燥及加速保存實驗[15]，尋找適合屎腸球菌規模生產的冷凍干燥保護劑和產品保存條件。

1 材料與方法

1.1 菌種、試劑與培養基

屎腸球菌由青島康地恩生物研發中心保存。

保護劑種類：脫脂奶粉、海藻糖、麥芽糊精、蔗糖。以玉米淀粉為保護劑對照。

MRS培養基：蛋白胨10g、牛肉膏 10g、酵母膏5g、K2HPO42g、檸檬酸銨2g、乙酸鈉 5g、葡萄糖20g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳 0.25g、吐溫-80 1mL，蒸餾水1L，溶解各組分，pH值調節至6.2～6.4，115℃滅菌30min。

1.2 儀器與設備

DH4000A培養箱 天津泰斯特儀器有限公司；PHS-3D pH計 上海精科儀器有限公司；SW-CJ-3D超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；H-1650離心機 湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化及擴培

取－80℃保存的屎腸球菌凍存管1支，在MRS平板上劃線，37℃培養36～48h，挑取單菌落接種于100mL液體MRS培養基中，37℃靜置培養24h后，以5%的接種量轉接至1L液體MRS培養基中擴大培養20h，進入穩定期，停止培養，測定活菌數，備用。

1.3.2 菌泥與菌懸液制備

將擴大培養好的發酵液置于離心機中，以轉速條件為5000r/min離心10min，棄掉上清液，用無菌水重懸，洗滌，按同樣轉速條件再次離心，即獲得冷凍干燥實驗所需的菌泥，并測定活菌數。

采用無菌水溶解凍干保護劑，加入菌泥，活菌數調節至1×1010CFU/mL，在磁力攪拌器上充分混勻菌懸液。

1.3.3 冷凍干燥

將添加保護劑的菌懸液倒入平板中，鋪成薄層，置于－40℃預凍，使得菌懸液中的水分充分凍結，然后在－80℃、真空度為3.5Pa條件下真空冷凍干燥24h，獲得凍干樣品。

1.3.4 收集存放條件及樣品貯存穩定性評價

冷凍干燥過程結束后，立即取出樣品，放置于鋁箔袋中，封口，分別放置于4℃和37℃條件下，每周取樣測定樣品活菌數，并計算樣品中剩余活菌存活率，以比較不同溫度條件下的貯存穩定性。

1.3.5 活菌數測定

樣品溶解于生理鹽水中混勻，以10倍梯度進行稀釋，取適合的稀釋度(最終菌落數約30～300CFU之間適宜)的試管中液體1mL置于平板中，與MRS培養基混勻，37℃培養48h后，計數菌落數，以菌落平均數計為該樣品的單位活菌數。

1.3.6 凍干樣品存活率計算

設冷凍干燥前菌泥活菌數為N1/(CFU/mL)；冷凍干燥后菌粉活菌數為N2/(CFU/mL)。

1.3.7 保護劑篩選

首先使用脫脂乳、蔗糖、麥芽糊精、海藻糖進行單因素試驗，同時選擇玉米淀粉為保護劑對照，無任何保護劑添加組作為空白對照；添加保護劑的處理組，保護劑質量濃度均為10g/100mL。觀察單一保護劑條件下的凍干存活率，及37℃(RH 75%)條件下貯存穩定性。

然后根據實驗結果及參考文獻[4,9-10,13]，將脫脂乳、蔗糖、麥芽糊精組合，進行三因素三水平的正交試驗，優化保護劑配方，實驗采用L9(33)正交表。比較各種保護劑組合的凍干存活率，選擇存活率最高的兩組，進行4℃和37℃條件下的貯存穩定性實驗，篩選出最優的保護劑配方。

2 結果與分析

2.1 單一保護劑對屎腸球菌凍干存活率的影響

圖1 單一保護劑對屎腸球菌凍干存活率的影響Fig.1 Effect of cryoprotectant type on survival rate of lyophilized E.faecium

冷凍干燥過程中會產生低溫、凍結及脫水等多種效應，因此，為了防止微生物在凍干過程中變性，選擇有效的保護劑至關重要。由圖1可知，所選的4種保護劑在相同的質量濃度下分別進行凍干實驗，屎腸球菌存活率在70%～80%之間，但玉米淀粉組和無保護劑的空白對照組存活率也分別達到了57%和76%，說明這株屎腸球菌本身有較好的凍干耐受性，而且凍干過程中，單一保護劑對這株屎腸球菌的存活率影響不大。

2.2 單一保護劑對屎腸球菌貯存穩定性的影響

圖2 添加單一保護劑后凍干樣品穩定性分析Fig.2 Effect of cryoprotectant type on storage stability of E.faecium at 37 ℃ (75% RH)

由圖2可知，在為期4周的貯存穩定性加速實驗中，各保護劑在貯存過程中對菌體都有一定的保護作用。海藻糖保護效果與其他3種保護劑相當，價格卻遠高于這些保護劑，不適于實際生產應用。而淀粉組和空白對照組菌量下降迅速，說明在沒有適當保護劑的情況下，即使微生物本身凍干耐受性較好，也無法較長期穩定保存。

2.3 正交試驗優化復合凍干保護劑

不同的保護劑在凍干過程中發揮著不同的作用，一般認為，低分子化合物(如低聚糖、氨基酸等)在凍干過程中直接發揮作用，而高分子化合物(如蛋白質、多糖等)則是促進低分子化合物的保護作用，本課題預實驗中選擇脫脂乳、蔗糖、麥芽糊精做單因素保護劑凍干實驗，選擇質量濃度為10g/100mL，凍干后屎腸球菌存活率在70%～80%之間；而在一般應用中，實驗室保存菌種有的單獨使用脫脂乳作為凍干保護劑，用量可達20g/100mL，有時則會搭配蔗糖，其用量達7g/100mL；但更多研究中，會配合使用脫脂乳、蔗糖甚至麥芽糊精等成分，各成分的用量在1～10g/100mL居多。如杜磊等[16]在乳酸菌冷凍保護劑的實驗中發現保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混菌保護劑最佳配方為10g/100mL蔗糖、10g/100mL脫脂乳及5g/100mL谷氨酸鈉，菌體經冷凍處理后存活率可達到95%；而郭云等[17]在研究中發現，以10g/100mL脫脂乳加5g/100mL海藻糖和5g/100mL蔗糖為基質進行噴霧干燥，菌體存活率最高達73.9%；麥芽糊精具有優良的乳化性能，有調整產品組織結構的作用，在食品及保健品中常作為壁材組分之一應用于噴霧干燥等后處理工藝[18-19]。因此，本實驗將脫脂乳、蔗糖、麥芽糊精組合，進行三因素三水平的正交試驗，優化保護劑配方，采用L9(34)正交表，結果如表1所示。

表1 復合保護劑對菌體凍干存活率的影響Table 1 Effect of complex cryoprotectant on survival rate of lyophilized E.faecium

由表1可知，影響屎腸球菌凍干后存活率的因素主次順序為B＞C＞A，即蔗糖的效果最明顯，麥芽糊精次之。

經正交試驗得到的最佳組合為1號試驗組：A1B1C1，即脫脂乳1g/100mL、蔗糖1g/100mL、麥芽糊精10g/100mL，凍干后菌體存活率達到84.4%。其次是4號試驗組：A2B1C2(脫脂乳5g/100mL、蔗糖1g/100mL、麥芽糊精5g/100mL)，凍干后菌體存活率達到83.1%。

蔗糖和麥芽糊精都屬糖類保護劑，糖類保護劑的保護作用在于抑制質膜的相變。即在微生物細胞脫水時進行“水置換”作用。凍干過程中，細胞膜質經歷了從液晶態到凝膠態的相的變化，而在室溫下復水時處于凝膠態的干燥質膜又經歷了從凝膠態到液晶態的轉變，由于膜經歷了狀態的轉變，某些區域產生缺陷，使細胞膜發生滲漏。若在干燥前加入二糖，如海藻糖或蔗糖，可降低干燥膜的膜相轉變溫度，當磷脂干燥脫水時，蔗糖在失水部位以氫鍵和磷脂的極性端相連，防止狀態的轉變和復水時的滲漏，從而提高細胞的存活率。

2.4 凍干樣品的穩定性分析

生物制品經冷凍干燥后制成凍干樣品，還需經歷長期儲存過程。通常，由冷凍干燥得到的樣品在長期的儲存過程活性組分會不斷變化，因此，以較好的保護劑組合制成的凍干樣品通過貯存穩定性的實驗分析，更有助于凍干樣品效果的評價。本實驗選擇正交試驗中屎腸球菌凍干存活率較高的1號和4號組合進行穩定性實驗，分別將凍干樣品置于4℃及37℃(RH 75%)條件下，定期測定樣品中的活菌數，結果如圖3、4所示。

由圖3可知，屎腸球菌凍干樣品在4℃條件下存放4周后，兩個不同保護劑組合的存活率均高于90%(將實驗初始測定時樣品存活率定為100%)，單位活菌量下降小，這說明了4℃的低溫存放效果好。而且，4號組合(脫脂乳5g/100mL、蔗糖1g/100mL、麥芽糊精5g/100mL)樣品存活率高于1號組合(脫脂乳1g/100mL、蔗糖1g/100mL、麥芽糊精10g/100mL)，菌量呈現增長的趨勢，這可能是由于在復水培養時保護劑成分有增菌作用所致。

圖3 4℃條件下凍干樣品的穩定性分析Fig.3 Stability of lyophilized E.faecium during storage at 4 ℃

圖4 37℃(RH 75%)條件下凍干樣品的穩定性分析Fig.4 Stability of lyophilized E.faecium during storage at 37 ℃ (RH 75%)

圖4 是屎腸球菌凍干樣品在37℃(RH 75%)條件下存放4周后的情況，存放前2周時，1號組合(脫脂乳1g/100mL、蔗糖1g/100mL、麥芽糊精10g/100mL)存活率已經降低至50%，而4號組合(脫脂乳5g/100mL、蔗糖1g/100mL、麥芽糊精5g/100mL)沒有明顯的存活率下降；4周后，1號組合和4號組合樣品的存活率分別降至38.4%和97.9%(將實驗初始測定時樣品存活率定為100%)。

經過4℃和37℃(RH 75%)的貯存穩定性實驗，可知凍干保護劑配方，4號組合穩定性優于1號組合。在貯存過程中，脫脂乳含量較高的組合表現較好，可能是脫脂乳的成分可以更好地直接與細胞膜表面極性磷脂集團相互作用，在菌體外形成蛋白膜，從而降低在貯存過程中細胞膜的損傷。而麥芽糊精在細胞脫水時不能充分置換水分子，所以1號組合，細菌細胞膜結構和功能的完整性不如脫脂乳含量較高的4號組合，在貯存過程中菌量損失相應較多。

3 結 論

屎腸球菌在凍干過程中選擇有效的保護劑至關重要，為尋找適于屎腸球菌規模化生產的凍干保護劑，本實驗將脫脂乳、蔗糖、麥芽糊精組合，通過正交試驗優化保護劑配方，得到的最佳組合為脫脂乳5g/100mL、蔗糖1g/100mL、麥芽糊精5g/100mL，此保護劑組合對屎腸球菌在冷凍干燥和干燥后貯存過程中均有顯著的保護作用，如：凍干后菌體存活率達到83.1%；使用鋁箔袋密封保存，在37℃(RH 75%)條件下存放4周后存活率為97.9%(將實驗初始測定時樣品存活率定為100%)。本實驗結果為屎腸球菌凍干產品制備和在常溫條件下貯運提供了直接參考。

另外，本實驗中發現使用此保護劑的屎腸球菌凍干樣品在4℃條件下存放4周后存活率高于100%，除球菌本身抗逆性較強外[3]，其原因和機理還需要進一步研究。

在乳酸菌的產業化開發過程中，菌株之間的個體差異、干燥方式和相應的保護方法、所生產制劑的貯存穩定性、使用效果評價等，都需要不斷的研究完善，以便持續提高微生態制劑的產品品質，保障消費者的健康和利益。

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