西藏地區傳統發酵乳中乳酸菌多樣性及微生物數量分析

陳芝蘭，楊吉霞，李夢寒，李曉衛，南志強，鞏文峰

(1.西藏大學農牧學院，西藏 林芝 860000；2.西南大學食品科學學院，重慶 400715)

西藏自治區是全國五大牧區之一，生活在該區域的藏民族多以飼養牦牛為生，該地區牦牛的數量約占全國總量的30%[1]。相對牛乳而言，牦牛乳含有較高的蛋白質、脂肪、乳糖和礦物質等營養成分，被稱為“天然濃縮乳”，是高原地區重要食品和乳品加工原料[2]。藏民族素有食用酸奶的傳統習慣，千百年來沿襲古老而傳統的方法制作酸奶。一般采用存放發酵奶和鮮奶的相同容器來進行持續發酵[3]，這也導致了當地的發酵產品逐漸演變，使產品不僅風味獨特、組織細膩、口感純正，同時還保存了自然環境中的乳酸菌資源。西藏地區海拔高，氣溫低，晝夜溫差大，紫外線輻射強，生態環境特殊，不同牧民家庭制備傳統發酵乳制品所采用的原料、工藝等方面的差異，以及不同地域的自然環境和氣候，造就了乳酸菌資源豐富的生物多樣性。對傳統乳制品中乳酸菌的分離、鑒定和生物學特性研究，有利于推動對我國傳統乳制品乳酸菌種類認識及其優良菌株在特色乳制品中的應用，具有十分重要的意義。

本實驗對從西藏地區采集的傳統發酵乳進行乳酸菌的分離、鑒定，旨在發現西藏地區所含乳酸菌類群，以期利用豐富我國的乳酸菌資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

樣品采自西藏自治區7個地區56戶牧民家庭。將牧民自然發酵制作的酸奶，在其發酵容器中充分攪拌后，吸取50mL裝入無菌容器中，均放入冰盒內，備用。在采樣現場用便攜式pH計測定酸奶的pH值。樣品采集地、樣品的代號和樣品數見表1。

表1 西藏發酵牛乳采集地點及數量Table 1 Fermented milk samples tested in this study

1.1.2 標準菌株

標準菌株Lactobacillus acidophilusATCC 4356T為CICC保藏菌種，其編號為CICC6075T。

1.1.3 試劑

培養基及生理生化實驗用試劑參照文獻[4-6]中的方法配制；緩沖液與常備試劑參照文獻[7]制備。Taq酶、dNTP、DNA Marker 天為時代生物有限公司；GoldView 北京塞百盛基因技術有限公司；溶菌酶、蛋白酶K、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十二烷基硫酸鈉(SDS) 北京華綠淵生物技術發展公司。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌和酵母菌數量分析

將發酵乳樣品用滅菌生理鹽水做10倍遞增稀釋，各取3個稀釋度，設3個重復。用MRS(加0.02g/100mL放線菌酮和多黏菌素)、PDA(加0.03g/100mL鏈霉素)培養基傾注培養，于37℃厭氧條件下培養48h，進行染色、鏡檢、計數。

1.2.2 乳酸菌的分離與純化

將發酵乳樣品劃線接種于含有10μg/g放線菌酮的MRS(加入0.5g/100mL碳酸鈣)瓊脂培養基上，37℃厭氧培養48h。記錄菌落形態，挑取有透明環的菌落，在MRS平板上反復劃線分離，至確定為純菌。將純化后的菌株進行斜面保存、甘油法低溫凍存。

1.2.3 乳酸菌的生理生化鑒定

按照文獻[5,8-11]介紹的方法，凡是革蘭氏陽性、過氧化氫酶實驗陰性的菌株初步確定為乳酸菌，然后按表2的鑒定程序及項目區分不同的乳酸菌菌屬，并通過形態特征、生理生化特征、糖發酵實驗等對種進行鑒定。

表2 乳酸菌鑒定程序及實驗項目Table 2 Identification procedure and indicators of lactic acid bacteria

1.2.4 16S rRNA基因序列同源性分析

將分離的乳酸菌菌株，提取基因組DNA[7,12]，采用正向引物27f：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’，反向引物1541r：5’-AAG GAG GTG ATC CACCC-3’，進行PCR擴增[13]，PCR純化產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

將測得乳酸菌菌株16S rRNA基因序列用BLAST(http://wwwncbi.nlm.nih.gov/blast/)在GenBank中搜索，與待測菌株同源性最高的已知分類地位的菌種初步確定待測菌株的種屬。然后從GenBank數據庫中下載已知的乳酸菌菌株的16S rRNA序列，以Clustal X[14]進行序列比對后，用MEGA4.0的UPGMA(unweighted pair-groupmethod with arithmetic means)法構建系統發育樹[15]，并進行1000次Bootstraps檢驗。利用16S rRNA基因序列同源性分析的方法進行鑒定。

2 結果與分析

2.1 傳統發酵牛乳中乳酸菌和酵母菌的分布

采用稀釋傾注選擇分離法在各樣品中均分離到乳酸菌和酵母菌，西藏7個地區56戶牧民家庭傳統發酵乳樣品中微生物數量和種類如表3所示。乳酸菌數量變化幅度為1.01～8.58(lg(CFU/mL))，乳酸菌平均含量為(6.38±1.54)(lg(CFU/mL))，各地區乳酸菌平均含量以山南、那曲＞昌都、日喀則＞林芝＞拉薩＞阿里，各個地區間乳酸菌平均含量差異達顯著水平(P＜0.05)，同一地區不同牧民家庭制作發酵乳乳酸菌含量差異以那曲最小，拉薩最大。而酵母菌數量變化幅度為2.09～7.16(lg(CFU/mL))，酵母菌平均含量為(5.27±1.63)(lg(CFU/mL))，各地區酵母菌平均含量以阿里地區顯著性(P＜0.05)高于其他地區，同一地區不同牧民家庭制作發酵乳酵母菌含量差異以阿里最小，昌都最大。采自阿里的兩份發酵乳酵母菌總數比乳酸菌總數大6個對數級，其他54份樣品中的乳酸菌總數比酵母菌的總數多，56份酸牛奶樣品中乳酸菌平均含量((6.38±1.54)(lg(CFU/mL)))比酵母菌平均含量((5.27±1.63)(lg(CFU/mL)))大1個對數級。結果表明西藏地區傳統發酵酸牛乳中富含乳酸菌和酵母菌，以乳酸菌為優勢菌群，微生物數量的差異可能和當地的地理位置、氣候及制作條件如接種量、接種時間、發酵溫度等因素有關。

表3 西藏發酵牛乳微生物組成分析Table 3 Microbial composition analysis of fermented milk samples collected in Tibet

2.2 乳酸菌生理生化鑒定結果

將分離的96株桿菌進行屬的鑒定，結果表明：均為革蘭氏染色陽性，無芽孢，不運動，在H2O2酶實驗、硝酸還原實驗、H2S實驗(與丹毒絲菌屬相區分)呈陰性，在pH 4.5的環境中生長(與肉食桿菌屬相區分)的桿菌，符合乳桿菌屬的生物學特性，被鑒定為乳桿菌屬的細菌。進一步以L.acidophilusATCC4356T(CICC保藏菌種，編號為CICC6075)為參考菌株，按照種特性實驗方法進行了種的鑒定[5,10]。結果(表4)表明：48個菌株(群1)大部分性狀一致，與L.casei的特性相近，18個菌株(群2)大部分性狀一致，與L.plantarum的特性相近，7個菌株(群3)大部分性狀一致，與L.fermentum的特性相近，4個菌株(群4)大部分性狀一致，與L.breris的特性相近，9個菌株(群5)大部分性狀一致，與L.parabuchneri的特性相近，5個菌株(群6)大部分性狀一致，與L.delbrueckiisubsp.bulgaricus的特性相近，2個菌株(群7)大部分性狀一致，與L.acidophilu的特性相近，3個菌株(群8)大部分性狀一致，將糖發酵等生理生化實驗結果查找文獻[5,10]無對應菌種。

表4 分離自西藏發酵乳中的乳酸菌的生理特性Table 4 Physiological and biochemical characteristics of lactic acid bacteria isolated from Tibetan fermented milk products

由表4可知，于MRS平板劃線厭氧分離的14株球菌革蘭氏染色陽性、H2O2酶陰性、不運動、硝酸鹽實驗陰性，符合乳酸球菌的特性。2個菌株葡萄糖產酸產氣似明串珠菌屬(Leuconostoc)。1個菌株在35℃和45℃均生長，在pH9.6不生長，在4.0g/100mL NaCl、6.5g/100mL NaCl生長，18g/100mL NaCl不生長符合片球菌屬(Pediococcus)的特征。2個菌株在10℃生長、45℃不生長，6.5g/100mL NaCl不生長，似乳球菌屬(Lactococcus)。1個菌株10℃和45℃、6.5g/100mL NaCl、pH9.6菌生長，葡萄糖產酸實驗陰性，似腸球菌屬(Enterococcus)。

2.3 16S rRNA基因序列分析

選取Lactobacillus、Leuconostoc等的代表菌株和沒有經生理生化鑒定到菌種的共33個菌株，提取其基因組DNA，擴增其16S rRNA基因序列進行測序，將16S rRNA基因序列在GenBank中進行同源序列搜索，各受試菌株與相關菌種的同源性都在99%以上。為顯示供試菌株與已知菌種之間的親緣關系及其系統地位，由待測33株乳酸菌的16S rRNA序列與12株參考菌株的16S rRNA序列用MEGA4.0軟件繪制系統發育樹，結果見圖1，系統發育樹以兩歧雙歧桿菌(B.bifidum)16S rRNA基因序列作為外群，序列一致長度為1400bp。45個序列的系統發育樹顯示10個分支：LZ3-1、LS11-1、RKZ1-3、SN11-1、RKZ3-1、NQ7-1、RKZ4-1、LS9-3、LS5-1、LS2-1、LS3-1、LS12-2、SN5-1、LS8-2、SN8-1和L.caseiATCC334 D86517處于一個分支；LS14-2、LS6-1、LS7-1、LS7-2、LS6-2和Lactobacillus paracaseiATCC25302 HQ23165、Lactobacillus caseiATCC339 AF469172處于一個分支；LS2-3和Lactobacillus fermentumCIP102980 JN175331處于一個分支；LS14-1、RKZ12-1、RKZ12-2和Lactobacillus diolivoransYIT10368 AB429369處于一個分支；NQ3-1和Lactobacillus parabuchneriDSM5707 AB370877處于一個分支；LS2-2和Lactobacillus brerisNRIC0137 AB362618處于一個分支；SN6-2、CD2-2、LS15-1和Lactobacillus plantarumNBRC15891 AB626055處于一個分支；LS4-1和Lactobacillus delbrueckiiBCRC10696 AY773948處于一個分支；LS3-4和Pediococcus acidilacticiNBRC12218 AB680261處于一個分支；NQ4-1、LS12-1和Leuconostoc mesenteroidesNRIC1541 AB023243處于一個分支。

圖1 分離乳酸菌菌株和相關菌株16S rRNA 基因序列建立的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA sequences of tested lactic acid bacteria and relevant strains

2.4 分離菌株的綜合鑒定結果

48株生理生化鑒定為L.casei的菌株，經16S rRNA基因序列分析結果為L.casei和L.paracasei，再次證實干酪乳桿菌群內的16S rRNA基因序列相似性達到99%以上，種水平分辨率比較低，采用表型特征鑒定和區分的準確性也會降低[16]；19株L.plantarum中，除1株菌可在45℃條件下生長外，其余18株生理生化鑒定結果與文獻[5,10]完全相符；分離自日喀則南木林縣RKZ12-1與RKZ12-2 和分離墨竹工卡扎雪鄉LS14-1的3株菌，糖醇發酵無相似種，16S rRNA基因測序鑒定與L.diolivoransYIT10368基因相似性高達99%；其他菌株生理生化鑒定結果與16S rRNA基因測序鑒定結果完全吻合。

根據表2和表4將乳酸球菌鑒定到4個屬，1株生理生化鑒定為片球菌屬的菌株與Pediococcus acidilacticiNBRC12218的基因相似性高達99%；明串珠菌屬內10個菌株碳水化合物發酵特征十分相似，單純依據生理生化指標，很難鑒定到種，16S rRNA基因測序鑒定結果，NQ4-14、LS12-1與Ln.mesenteroidesNRIC1541的基因相似性高達99%。總體來說，生理生化結果與16S rRNA基因序列鑒定結果能較好地相吻合。

2.5 發酵乳中乳酸菌種類及分布

表5 西藏地區乳酸菌屬型及乳桿菌分布Table 5 Classification and distribution of the genus and species in fermented milk products from different pasturing areas of Tibet

由表5可知，從西藏7個地區56份發酵乳中均分離到乳酸菌。共分離乳酸菌110株，經鑒定分別歸為乳桿菌屬(96株)、明串珠菌屬(10株)、乳球菌屬(2株)、腸球菌屬(1株)、片球菌屬(1株)5個屬。其中，歸于乳桿菌屬的有8個種，L.casei(占分離株的43.64%)為優勢種，分布于整個西藏地區的傳統發酵乳制品中，其次為L.plantarum，再次為L.parabuchneri；菌株多樣性豐富度以RKZ、LS＞SN＞NQ＞CD＞LZ＞AL；基物樣品分離比在1～2.75間，以CD最高，AL最低；分離到的乳酸桿菌和乳酸球菌的比例相差較大，乳酸桿菌占87.27%，為優勢發酵菌群。

3 結 論

3.1 本研究從西藏地區自然發酵的56份酸奶樣品中，共分離出110株乳酸菌。其中，乳酸桿菌96株占分離株的87.27%，為優勢菌群，分別是L.casei48株、L.plantarum18株、L.parabuchneri9株、L.fermentum7株、L.delbrueckiisubsp.bulgaricus5株、L.breris4株、L.acidophilus2株、L.diolivorans3株，L.casei占分離株的43.64%，是優勢菌群；10株乳酸球菌為明串珠菌屬(Leuconostoc)10株、乳球菌屬(Lactococcus)2株、腸球菌屬(Enterococcus)1株、片球菌屬(Pediococcus)1株；56份發酵乳中乳酸菌數平均含量為(6.38±1.54)(lg(CFU/mL))，酵母菌平均含量為(5.27±1.63)(lg(CFU/mL))，乳酸菌比酵母菌高一個對數級，為主要發酵菌群。

3.2 傳統發酵乳制品常常是混合菌株發酵，不同區域發酵乳中乳酸菌的種類有差異，但菌株與區域之間無必然聯系，L.casei分布于整個西藏地區的傳統發酵乳制品中，其次為L.plantarum，再次為L.parabuchneri，日喀則和拉薩地區菌株豐富度較好。分菌時根據菌落、菌體形態從同一樣品中分出許多不同的菌株，但序列測定發現這些“不同”的菌都歸于同種菌，同種菌株間形態和生理生化特性略有差異。

3.3 從西藏牧民家庭自制的發酵乳中分離到的乳桿菌大多是15、37℃生長、45℃弱生長的中溫菌株。其原因與牧區牧民家庭制作的發酵乳，往往存放在非恒溫狀態的環境中，菌株經過長期適應西藏相對低溫氣候環境，形成了這種在廣泛溫度范圍內生長的特性，說明被分離菌株的適應能力增強。

3.4 分離鑒定的110株乳酸菌，涉及到乳品中常見也是發酵工業上常用的乳酸菌。乳桿菌屬中鑒定出8種乳桿菌分別為3種發酵類群，且都能發酵乳糖。分離的乳桿菌普遍具有發酵果糖、棉子糖、蜜二糖的能力，這些差異可能與環境條件有關。分離鑒定的乳球菌菌株無論是種類還是數量都很少，這可能與酸奶較低的pH值(pH值為3.70±0.24)有關[17]，致使乳球菌生長受到抑制，活性也不高。14株球菌中，明串珠菌(10株)占優勢，可能正是它們賦予了酸奶優良的風味和質地。

3.5 采用傳統的培養法在MRS培養基于37℃厭養培養分析傳統乳制品中微生物的多樣性，但某些乳酸菌由于其活力不夠、適應相對低溫氣候環境或不可在分離培養基中生長，不能被有效地分離，造成對環境微生物多樣性的低估[18]，須采用更多培養方法和分子生物學的方法相結合考察乳制品中微生物的多樣性。

3.6 實驗中傳統與分子生物學分類結果相符。但傳統的生理生化方法鑒定乳酸菌耗時長，而且，其鑒定結果也有不確定性[19]，采用16S rRNA序列分析對發酵酸乳中乳酸菌進行分子生物學鑒定，比傳統的生化實驗鑒定準確度高、結果更可靠，因此，認為只有將分子生物學技術和傳統的生理生化實驗方法結合起來才能更加準確的鑒定出乳酸菌。

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