不同抗凝劑、不同保存溫度和保存時間對降鈣素原檢測的影響

徐全中， 王偉佳， 闞麗娟， 嚴海忠， 幕月晶， 歐陽能量， 黃燕華， 張秀明

(中山大學附屬中山醫(yī)院檢驗醫(yī)學中心，廣東中山528403)

降鈣素原(procalcitonin，PCT)是無激素活性的降鈣素前肽物質，是由116個氨基酸組成的相對分子質量為13 000［1］的糖蛋白。在生理情況下，主要是由甲狀腺濾泡細胞產生，其濃度通常＜0.1 ng/mL［2］。1993 年，Assicot 等［3］首先提出PCT可以作為細菌感染的標志物。嚴重感染患者的PCT顯著升高，并與感染的嚴重程度及臨床預后密切相關［4］。其在感染后2～4 h即可升高，8～24 h就可以升高到峰值，并且其半衰期較長(20～24 h)，近年來PCT在提示細菌感染及其感染程度、判斷治療效果、指導抗菌藥物治療等方面發(fā)揮了重要的作用。作為臨床實驗室，對PCT檢測時選擇何種抗凝劑、采血后多長時間進行檢測仍然有效和如何有效的保存標本是我們關心的問題，我們對此進行了探討。

材料和方法

一、材料

采血管采用BD公司的真空采血管。肝素鋰管批號為1213622，抗凝劑為75 USP Units;乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)管批號為1146897，抗凝劑3.6 mg;分離膠管批號為1179948;普通干燥管批號為1167597。Roche Cobas e601電化學發(fā)光免疫分析儀及其配套試劑、校準品、質控品(試劑批號為162192;校準品批號為162192;質控品批號為低值16195300，高值16195400)和配套消耗品。

二、方法

1.Roche Cobas e601電化學發(fā)光免疫分析儀檢測PCT的精密度驗證 參考美國臨床實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的EP15-A2文件《用戶對精密度和準確度性能的核實試驗2批準指南》［5］，選用5個不同濃度的標本，每個標本每天重復測定4次，持續(xù)5 d。計算分析內不精密度為1.04%，總不精密度為1.21%。儀器完全滿足臨床檢測需要。

2.血液標本的采集 疑似細菌感染的住院患者13例，其中男7例，女6例，平均年齡45歲。空腹抽取靜脈血分別注入真空干燥管、分離膠管、肝素鋰管和EDTA-K2管中。普通干燥管和分離膠管室溫(20～25℃)放置30 min，待血液凝固后1 300×g離心10 min分離血清，肝素鋰管和EDTA-K2管顛倒混勻后即刻1 300×g離心10 min分離血漿。分離的血清或血漿各分裝若干份于EP管密封備用。

3.分析方法 (1)不同抗凝劑對PCT檢測結果的影響分析:用Roche Cobas e601電化學發(fā)光免疫分析儀對13例分裝于真空干燥管、分離膠管、肝素鋰管和EDTA-K2管分離的患者血清或血漿分別在即刻、12、24和72 h進行測定;(2)不同保存溫度和保存時間對PCT檢測結果的影響分析:用前一步選出的最適采血管，采集9例疑似細菌感染的住院患者(其中男4例，女5例，平均年齡41歲)血清或血漿，分別置于4、－30和－70℃保存，即刻分離血清或血漿時測定1次，4℃保存的標本分別在12 h、24 h、72 h、7 d進行測定，－30和－70℃保存的標本分別在24 h、72 h、7 d進行測定(－70℃保存的標本在7 d進行檢測之前反復凍融2次)。

三、統(tǒng)計學方法

結 果

一、血清和不同抗凝劑的血漿檢測結果

比較13例標本不同采血管的即刻檢測結果，差異均不超過15%。EDTA-K2是試劑盒推薦的抗凝劑，并且以EDTA-K2抗凝的血漿PCT在72 h內的降解速率最慢，以EDTA-K2抗凝血漿即刻檢測平均濃度作為百分百標準參照，普通干燥管檢測平均濃度為102.84%，有+2.84%的差異;分離膠管為111.47%，有+11.47%的差異，肝素鋰管為97.24%，有－2.76%的差異。

二、血清和不同抗凝劑的血漿在不同放置時間的降解百分率

13例標本不同采血管分離的血清或血漿室溫下放置，12 h時 EDTA-K2管平均降解了(2.61±0.56)%，比較其他采血管，其降解速率最慢。分離膠管平均每小時降解0.46%，降解最快。在24 h時，普通干燥管、分離膠管、肝素鋰管、EDTA-K2管分別平均降解了(9.66±1.60)%、(11.01±1.62)%、(8.00±0.91)%、(3.86±0.76)%。放置72 h時，分離膠管平均降解率達到(41.25±1.68)%，仍為降解最快，而 EDTA-K2管則僅平均降解(15.77±1.65)%。見圖1。

三、EDTA-K2抗凝血漿不同保存溫度下不同保存時間檢測結果

9例EDTA-K2抗凝標本即使存放于4℃，在7 d時與分離血漿即刻測定差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);存放于－70℃，7 d疊加反復凍融2次對測定結果無明顯影響。見表1。

討 論

健康成人血中的PCT濃度很低，但在嚴重的全身感染時可以在2～4 h升高，并且很快就可以達到峰值。Müller等［6］通過對79例懷疑感染的住院兒童進行研究，發(fā)現(xiàn)在嚴重感染(細菌、寄生蟲或真菌感染)并有全身表現(xiàn)時，血PCT含量明顯升高，而病毒感染和局部細菌感染沒有全身表現(xiàn)的患者血PCT含量水平僅輕度升高。另外，監(jiān)測血PCT水平還有助于臨床正確、合理使用抗菌藥物［7］。由于其在鑒別系統(tǒng)感染和非感染性炎癥，及其嚴重程度、抗菌藥物治療、預后等方面發(fā)揮的重要作用，使其成為臨床常規(guī)檢測項目。臨床常用血清作為檢測標本，而在急診檢驗工作中，多數(shù)用血漿標本做檢驗，用血漿作為標本的優(yōu)點在于可以立即離心，縮短血液分離時間［8］。不同的抗凝劑、不同的存放條件和不同的存放時間對檢測結果是否有影響以及影響大小還不清楚。1997年Meisner等［9］曾對PCT檢測的影響因素做過研究，但其對有些影響因素(抗凝劑種類、標本的保存溫度和保存時限)的研究還是比較局限，國內可以作為一定的參考但未必適用，國內是怎樣的情況鮮有報道，為此我們對該方面做了進一步的探討。

在對普通干燥管、分離膠管、肝素鋰管和EDTA-K2管的研究中，肝素鋰管比EDTA-K2管偏低2.76%。曾有報道，肝素對標記免疫分析影響程度的高低因方法與檢測項目不同而不同［10-11］。本試驗使用電化學發(fā)光法進行檢測，可能是由于肝素具有強酸性并帶有負電荷，會影響化學反應的催化環(huán)境、緩沖體系甚至是化學反應本身，使其檢測結果偏低。普通干燥管和分離膠管測定結果比 EDTA-K2抗凝管結果分別偏高 2.84%、11.47%，至于造成這種差異的具體原因不明，還有待進一步探討。用普通干燥管、分離膠管、肝素鋰管、EDTA-K2管處理的血液標本，分離后室溫存放，在12、24和72 h測定均是EDTA-K2抗凝血標本降解速率最慢，前12 h平均每小時降解速率不足0.22%，即使存放 72 h也才降解(15.77±1.65)%，平均每小時降解速率與前12 h每小時降解速率基本一致。EDTA-K2抗凝血標本存放于4、－30和－70℃條件下，在7 d內基本無降解，甚至在－70℃條件下保存即使反復凍融2次對檢測結果的影響也很有限。

為保證檢測結果的準確、及時、有效，可以從提高檢驗人員的業(yè)務水平、改進工作流程、縮短檢測時間等方面來減少標本放置時間過長帶來的影響。血漿中的PCT非常穩(wěn)定，實驗室可用常規(guī)的方法進行收集，無需特殊的儲存條件。作為電化學發(fā)光法檢測，本研究證實采用EDTA-K2作為抗凝劑采集標本不但縮短了標本檢測，而且檢測結果良好，并且長時間保存只具有很小的降解速率。但為了保證結果的準確，各個實驗室應使用其各自方法推薦的抗凝劑在推薦的時間內進行檢測。

［1］Snider RH Jr，Nylen ES，Becker KL.Procalcitonin and its component peptides in systemic inflammation:immunochemical characterization［J］.J Investig Med，1997，45(9):552-560.

［2］Gendrel D，Bohuon C.Procalcitonin，a marker of bacterial infection［J］.Infection，1997，25(3):133-134.

［3］Assicot M，Gendrel D，Carsin H，etal.High serum procalcitonin concentrations in patients with sepsis and infection［J］.Lancet，1993，341(8844):515-518.

［4］Phua J，Koay ES，Lee KH .Lactate，procalcitonin，and amino-terminal pro-B-type natriuretic peptide versus cytokine measurements and clinical severity scores for prognostication in septic shock［J］.Shock，2008，29(3):328-333.

［5］Clinical and Laboratory Standards Institute.User demonstration of performance for precision and accuracy［S］.EP15-A2，CLSI，2004.

［6］Müller B，Harbarth S ，Stolz D，etal.Diagnostic and prognostic accuracy of clinical and laboratory parameters in community-acquired pneumonia［J］.BMC Infect Dis，2007，7:10.

［7］Bouadma L，Luyt CE，Tubach F，etal.Use of procalcitonin to reduce patients' exposure to antibiotics in intensive care units(PRORATA trial):a multicentre randomised controlled trial［J］.Lancet，2010，375(9713):463-474.

［8］葉應嫵，李建齋，王玉琛 .臨床試驗診斷學［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1991:344.

［9］Meisner M，Tschaikowsky K，Schnabel S，etal.Procalcitonin-influence of temperature， storage，anticoagulation and arterial or venous asservation of blood samples on procalcitonin concentrations［J］.Eur J Clin Chem Clin Bio Chem，1997，35(8):597-601.

［10］Hutchesson AC，Hughes SV，Bowden SJ，etal.In vitro stability of endogenous parathyroid hormonerelated protein in the blood and plasma［J］.Ann Clin Biochem，1994，31(Pt 1):35-39.

［11］陳望榮，楊綠舜，鄭定容.CK-MB在肝素鈉管與普通干燥管中的檢測的比較［J］.實用醫(yī)技雜志，2008，15(11):1415-1416.