乙型肝炎表面抗原金標法陽性而酶聯免疫吸附試驗陰性的原因分析

王 雷，蔡偉?。ńK省宿遷市中心血站 223800）

我國是乙型肝炎（下稱乙肝）病毒感染的中度流行區，乙肝病毒攜帶者數量已由9.75%降至7.18%。輸血是乙肝病毒經血傳播的重要途徑之一，為了防止乙肝病毒經血傳播，提高血液質量，血站現在一般都用膠體金法和酶聯免疫吸附試驗（ELISA）對獻血者的血液樣本進行篩查檢測。但在日常工作中會碰到兩種方法檢測結果不一致的現象，現對膠體金法陽性而ELISA結果陰性的現象分析如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 來源于本站2010年夏季夜間采血的1位無償獻血者（以前獻過2次血液）的血液標本，乙二胺四乙酸二鉀（EDTA－K2）抗凝經正確處理后得到的待檢血漿。

1.2 試劑 廈門英科新創公司提供的乙肝表面抗原金標法試紙條，有出廠合格證、在有效期內使用；廈門英科新創公司提供的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）酶聯免疫診斷試劑盒（一步法和兩步法）；珠海麗珠公司提供的HBsAg酶聯免疫診斷試劑盒（一步法和兩步法）。所用酶聯免疫檢測試劑均經SFDA批準，批批檢合格，并在有效期內使用。

1.3 儀器 Eppendorf－Refrence移液器（10～100μL、德國Eppendorf公司）、MicroLab STAR IVD ELISA－8CH加樣系統（瑞士哈美頓公司 Hamilton AG）、FAME24/20（瑞士哈美頓公司Hamilton AG），儀器均每年定期校驗。

1.4 方法

1.4.1 金標法嚴格按說明書上要求操作，重復測定3次。

1.4.2 ELISA采用雙抗夾心法及TMB顯色，在E－STAR8CH上加完樣后在FAME上進行自動處理。先用兩廠家的一步法試劑檢測，再用兩廠家提供的兩步法試劑檢測。

2 結 果

金標法三次試驗均快速顯示強陽性，無償獻血者標本呈陽性反應（2min左右檢測線處出現一條紫紅色線條；隨后1min左右質控線處出現一條紫紅色線條），陽性對照（3ng/mL）呈陽性反應（4min左右檢測線處出現一條紫紅色線條；隨后1min左右質控線處出現一條紫紅色線條）。而兩個廠家提供的ELISA一步法和兩步法試劑盒檢測結果都為陰性，具體數據為英科新創試劑一步法的S/CO值為0.076；兩步法的S/CO值為0.181；珠海麗珠試劑一步法的S/CO值0.015，兩步法的S/CO值為0.048。

3 討 論

膠體金免疫層析法檢測HBsAg是用膠體金代替酶標記抗－HBs，樣品中HBsAg與金標記抗－HBs單抗結合物結合后沿硝酸纖維素膜遷移，在包被有抗－HBs多抗處（檢測線）形成“金標記抗－HBs單抗－HBsAg－抗－HBs多抗”夾心物而出現紅色線。一般出現假陽性的可能性有：（1）交叉反應。HBsAg可能與其他病毒存在交叉性，如漢坦病毒[1]；（2）試劑本身的問題。不同廠家、不同批號間的差異；（3）注射乙肝疫苗的初期；（4）標本溶血。

ELISA測定HBsAg多采用雙抗體夾心法，在微孔條上預包被純化的乙肝表面抗體（抗－HBs），配以酶標記抗體（抗－HBs－HRP）及TMB顯色劑等其他試劑來檢測血漿（或血清）中的HBsAg。一般國產試劑其檢測靈敏度可達到0.5ng/mL，但是在日常實驗中也有假陰性的出現，可能的原因有：（1）病毒株的變異。預包被的抗體都是單克隆抗體，一般對HBsAg亞型都能檢出來，但如果病毒株變異產生新的亞型時就有可能出現陰性；（2）HOOK效應。一步法測定HBsAg時，若標本HB－sAg濃度過高，有可能發生競爭抑制，不形成“夾心復合物”，產生HOOK[2]效應；（3）隱匿性 HBV感染。病毒基因整合到宿主染色體，聯合其他病毒的感染而影響到HBsAg的表達[3]等；（4）操作上的誤差。如加樣問題、洗板和孵育等等，還有試劑本身的差異。如機體不明原因的而導致的HBsAg效價降低和體內嗜異性抗體的干擾等。無論是出現假陽性或是假陰性都會對無償獻血工作帶來影響[4]。假陽性會造成血液的浪費，甚至會增加獻血員的思想負擔；假陰性又會影響血液的質量，造成病毒的傳播感染。因此，對于這些假陰或者假陽的獻血員，臨床工作者中許可以建立一種確認機制，對其進行定期的隨訪和多項目的檢測（如兩對半檢測、NAT檢測等），這對于降低輸血傳播乙型肝炎病毒的危險性、減少輸血糾紛，提高血液安全和輸血事業的可持續發展等具有重要的意義。

[1] 席加秋，王中琳.漢坦病毒對膠體金檢測乙肝表面抗原的影響[J].上海醫學檢驗雜志，2001，16（3）：149.

[2] 鄭懷競，韓松.臨床檢驗ELISA指南[M].北京：北京醫科大學/中國協和醫科大學聯合出版社，1994：4.

[3] 楊生義，李文凡.獻血員HBsAg篩查的安全性和病毒變異分析[J].中國熱帶醫學，2010，10（6）：674－676.

[4] 楊俠宇.金標法檢測乙型肝炎表面抗原漏檢原因分析[J].檢驗醫學與臨床，2011，8（10）：1279－1280.