巴西綠蜂膠乙醇提取前后揮發(fā)性成分的分析比較

黃 帥， 盧媛媛， 張翠平， 胡福良

（浙江大學 動物科學學院，浙江 杭州 310058）

蜂膠是工蜂采集植物樹脂等分泌物與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合形成的一種粘稠物質(zhì)[1]。蜂膠的基本成分包括大約50%的樹酯和樹香、30%左右的蜂蠟、10%的芳香揮發(fā)油、5%的花粉以及5%雜質(zhì)。蜂膠的化學成分十分復雜，主要包含黃酮類化合物、酚酸類化合物、醛酮類化合物及萜類化合物、維生素、多種氨基酸、木脂素類及脂肪酸類等，至今為止已經(jīng)從蜂膠中檢測出300多種物質(zhì) ，它們的存在與協(xié)同作用對蜂膠生物活性的發(fā)揮有積極意義[4-7]。隨著研究的不斷深入，眾多學者證實了蜂膠具有抗真菌、抗病毒、抗細菌、抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤以及增強免疫力等諸多藥理活性[10]，越來越受到人們的關注，被譽為“紫色黃金”的美稱[11]。

蜂膠中的揮發(fā)性成分（精油）主要由醇、醛、酮、醚、酯、羧酸等含氧基團的化合物組成，其主要活性成分是萜烯類及其含氧衍生物。它們與蜂膠中的其它生物學活性物質(zhì)協(xié)同，共同體現(xiàn)蜂膠的生物學及藥理學活性[12-13]。目前很多文獻對蜂膠中功效成分的研究主要集中在其非揮發(fā)性成分方面，尤其是蜂膠中的黃酮類化合物，通常被作為蜂膠品質(zhì)及生物學活性高低的一大指標進行評價，而對蜂膠中的揮發(fā)性成分研究較少[14-16]。

作者利用超聲波輔助提取技術對巴西綠蜂膠原膠、乙醇提取液及蜂膠渣中的揮發(fā)性成分進行提取，并利用GC-MS技術對其進行分析，比較其在含量及化學組成上的差異，以期為蜂膠的綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

巴西綠蜂膠原膠采自巴西；蜂膠乙醇提取液由巴西綠蜂膠原膠溶解于體積分數(shù)75%的乙醇溶液制得；蜂膠渣為巴西綠蜂膠經(jīng)乙醇浸提過濾后剩余殘渣干燥后所得。

1.2 主要試劑

石油醚、無水乙醇、正己烷等，均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 主要儀器與設備

旋轉蒸發(fā)儀RE-52AA:上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；循環(huán)水式多用真空泵 SHB-III:鄭州長城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；NJL07-3型實驗專用微波爐:南京杰全微波設備有限公司產(chǎn)品；EQ-500E型超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；GC-MS聯(lián)用儀6890N/5975B:安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；HP-5MS 毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。

1.4 實驗方法

1.4.1 蜂膠醇溶液的制備 將巴西綠蜂膠原膠放入-18℃冷凍12 h后，粉碎成粉末，過20目篩備用。準確稱取83.5 g蜂膠粉末，溶解于體積分數(shù)75%的乙醇溶液中（料液質(zhì)量體積比為1 g∶10 mL），70℃震蕩提取30 min。提取兩次，過濾，然后用50 mL體積分數(shù)75%的乙醇洗滌殘渣，合并濾液并且定容至500 mL制得蜂膠醇溶液。

1.4.2 蜂膠渣的制備 蜂膠醇溶液轉移出后，將剩下的固體轉移到蒸發(fā)皿中，并用體積分數(shù)75%的醇洗滌干凈試管。連同洗滌液一起倒入蒸發(fā)皿中，把蒸發(fā)皿放入烘干箱中進行烘干，制得蜂膠雜質(zhì)。

1.4.3 原膠揮發(fā)性成分的制備 準確稱取過篩蜂膠原料10 g，置于250 mL圓底燒瓶中，加入150 mL石油醚，59℃超聲提取62 min，提取2次，過濾，再用20 mL石油醚洗滌殘渣，合并濾液減壓濃縮至100 mL左右，置于-18℃冰柜中反復冷凍過濾，達到無蠟質(zhì)析出為止。濾液于45℃旋轉蒸發(fā)脫溶，得到蜂膠揮發(fā)性成分粗提物，將蜂膠揮發(fā)性成分粗提物與無水乙醇按質(zhì)量體積比1 g∶15 mL充分混勻，于-20℃反復冷析過濾，達到無蠟質(zhì)析出為止。采用旋轉蒸發(fā)儀去除濾液中的溶劑得到蜂膠揮發(fā)性成分。計算得率，同一條件重復3次取平均值。4℃冰箱保存。

1.4.4 蜂膠乙醇提取液中揮發(fā)性成分的制備 準確稱取100 mL蜂膠乙醇提取液，減壓濃縮至無乙醇析出，濃縮液置于250 mL圓底燒瓶中，以石油醚為溶劑，料液質(zhì)量體積比為1 g∶15 mL，59℃超聲提取62 min，提取2次，提取液經(jīng)分液后取醚相，置于-18℃冰柜中反復冷凍、過濾去除析出蠟質(zhì)。將脫蠟處理的濾液于40℃旋轉蒸發(fā)脫溶，得到蜂膠揮發(fā)性成分，計算得率。同一條件重復3次取平均值。4℃冰箱保存。

1.4.5 蜂膠渣中揮發(fā)性成分的制備 準確稱取10 g蜂膠渣干燥粉末，置于250 mL圓底燒瓶中，加入150 mL石油醚，59℃超聲提取62 min，提取2次，過濾，再用20 mL石油醚洗滌殘渣，合并濾液減壓濃縮至100 mL左右，置于-18℃冰柜中反復冷凍、過濾去除析出蠟質(zhì)。將脫蠟處理的濾液于40℃旋轉蒸發(fā)脫溶，得到蜂膠渣揮發(fā)性成分粗提物。將蜂膠渣揮發(fā)性成分粗提物與無水乙醇按質(zhì)量體積比1 g∶15 mL充分混勻，于 -20℃反復冷析過濾，達到無蠟質(zhì)析出為止。采用旋轉蒸發(fā)儀去除濾液中的溶劑得到蜂膠揮發(fā)性成分，計算得率。同一條件重復3次取平均值。4℃冰箱保存。

1.4.6 GC-MS分析條件 樣品溶于正己烷中過0.45 μm濾膜后進行GC-MS分析。GC條件:色譜柱為 HP-5MS 毛細管柱（30 m×0.25 mm）；載氣:氦氣；流量:1 mL/min；進樣口溫度250℃；分流進樣量:1.0 μL；分流比 20∶1；柱溫升溫程序:初始 80 ℃，保持5 min，以5℃/min速度升溫至185℃，保持5 min。MS條件:電離方式為EI；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；接口溫度280℃；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍為 30～500。

2 結果與分析

用超聲波輔助有機溶劑提取法對蜂膠原膠、蜂膠乙醇提取液及蜂膠渣中揮發(fā)性成分進行提取，得到揮發(fā)性成分的得率及色澤、性狀、氣味情況見表1。由表1可見，采用超聲波輔助提取的方法，蜂膠原膠、蜂膠乙醇提取液及蜂膠渣中揮發(fā)性成分得率分別為5.43%、0.28%和3.63%，揮發(fā)性成分在蜂膠原膠中最多而在蜂膠乙醇提取液中最少。以上結果說明，蜂膠通過乙醇浸提法制備蜂膠酊這一加工過程中，損失了一定量的揮發(fā)性物質(zhì)，在乙醇提取后所得蜂膠殘渣中還含有大量的揮發(fā)性成分。對比蜂膠原膠、蜂膠乙醇提取液及蜂膠渣中提取得到揮發(fā)性成分的物理性狀可見，蜂膠原膠和蜂膠渣的揮發(fā)性成分為深綠色，蜂膠乙醇提取液的揮發(fā)性成分為綠色。在氣味上，三者均具有濃郁的蜂膠特有香味，其中蜂膠原膠中提取得到的揮發(fā)性成分香味略帶辛辣。

對巴西綠蜂膠原膠、乙醇提取液及蜂膠渣超聲波輔助提取所得揮發(fā)性成分進行GC-MS分析，結果如圖1～3所示。來源于三者的蜂膠揮發(fā)性成分化學組成復雜，在化合物組成及豐度上存在差異。

表1 蜂膠原膠、蜂膠乙醇提取液及蜂膠渣中揮發(fā)性成分得率 （±s，n=3）Table 1 Yield of volatile components in raw material，PEES and DPEES respectively（±s，n=3）

表1 蜂膠原膠、蜂膠乙醇提取液及蜂膠渣中揮發(fā)性成分得率 （±s，n=3）Table 1 Yield of volatile components in raw material，PEES and DPEES respectively（±s，n=3）

樣品 揮發(fā)性成分得率/% 色澤 性狀 氣味蜂膠原膠 5.43±0.21 深綠色 油狀，35℃以下凝固為脂質(zhì)物 濃郁的蜂膠味，微辛辣蜂膠乙醇提取液 0.28±0.02 綠色 油狀，35℃以下凝固為脂質(zhì)物 濃郁的蜂膠味蜂膠渣 3.63±0.15 深綠色 油狀，35℃以下凝固為脂質(zhì)物 濃郁的蜂膠味

在確定各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)和掃描峰號后，經(jīng)NIST/WILEY檢索數(shù)據(jù)庫進行檢索并根據(jù)文獻進行譜圖解析，采用峰面積歸一化法計算解析組分的百分含量。經(jīng)分析得到蜂膠原膠、蜂膠乙醇提取液、蜂膠渣揮發(fā)性成分中的主要物質(zhì)如表2所示。由表2可見，蜂膠原膠中鑒定出的揮發(fā)性成分中主要物質(zhì)包括芳香酸及烯萜類含氧衍生物等有機化合物（質(zhì)量分數(shù)），如:氫化肉桂酸（14.933%）、反式-橙花叔醇（14.744%）、3-苯丙酸乙酯（3.889%）、（+）-d-杜松烯（3.516%）、石竹烯（2.948%）等 14種，占總揮發(fā)性組分含量的63.533%；蜂膠乙醇提取液中鑒定出的揮發(fā)性成分中主要物質(zhì)包括烯萜類化合物、烷烴化合物以及有機酸酯類物質(zhì)，如:氫化肉桂酸（20.799%）、反式-橙花叔醇（10.432%）、3-苯丙酸乙酯 （9.929%）、 正二十三烷 （3.514%）、 正三十烷（2.232%）等14種，占總揮發(fā)性組分含量的63.271%；蜂膠渣中鑒定出的揮發(fā)性成分中主要物質(zhì)包括烯萜類和有機酸酯類化合物，如:3-苯丙酸乙酯（16.752%）、反式-橙花叔醇（9.798%）、（+）-d-杜松烯（4.390%）、（-）-a-芹子烯（2.949%）等 11 種，占總揮發(fā)性組分含量的52.53%。分析比較后發(fā)現(xiàn)三者揮發(fā)性成分中含有一定量的相同物質(zhì)同時也含有一定量的不同物質(zhì)，但是各物質(zhì)的含量差異較大。3種物質(zhì)揮發(fā)性成分中共有3-苯丙酸乙酯、石竹烯、反式-橙花叔醇、（+）-d-杜松烯等5種成分，占蜂膠原膠、蜂膠醇提取液、蜂膠渣總揮發(fā)性組分含量相對較高，分別為32.993%、29.177%和41.355%。共有組分可能是蜂膠特有香味的主要來源。

圖1 蜂膠原膠中揮發(fā)性成分的氣相色譜-質(zhì)譜圖譜Fig.1 GC-MS spectrum of volatile components in raw material

圖2 蜂膠乙醇提取液中揮發(fā)性成分的氣相色譜-質(zhì)譜圖譜Fig.2 GC-MS spectrum of volatile components in PEES

圖3 蜂膠渣中揮發(fā)性成分的氣相色譜-質(zhì)譜圖譜Fig.3 GC-MS spectrum of volatile components in DPEES

對蜂膠原膠、蜂膠乙醇提取液及蜂膠渣揮發(fā)性成分中的主要物質(zhì)分析比較后發(fā)現(xiàn)，巴西綠蜂膠原膠揮發(fā)性成分中的主要物質(zhì)為有機酸酯、烷烴類化合物、醇類化合物及大量的萜烯類化合物，而在蜂膠乙醇提取液揮發(fā)性成分中除了含有機酸酯、烷烴類化合物、醇類化合物、萜烯類化合物外，還含有16碳以上的機酸酯類化合物（即鄰苯二甲酸二丁酯），這主要是由于經(jīng)乙醇提取，蜂膠原膠揮發(fā)性成分中的一些酸類與乙醇起酯化反應生成了酯類化合物，如蜂膠原膠揮發(fā)性成分中的氫化肉桂酸易與醇起酯化反應生成氫化肉桂酸乙酯（即3-苯丙酸乙酯）；蜂膠渣揮發(fā)性成分中活性物質(zhì)主要為有機醇、烷烴及萜烯類化合物，還含有少量的酯類化合物，這是由于經(jīng)乙醇提取，蜂膠原膠揮發(fā)性成分中的一些酸類與乙醇起酯化反應生成了酯類化合物，殘留到蜂膠渣中。如:蜂膠原膠揮發(fā)性成分中的氫化肉桂酸易與醇起酯化反應生成氫化肉桂酸乙酯（即3-苯丙酸乙酯），這種物質(zhì)溶于醇、醚，不溶于水，實驗所用的醇是體積分數(shù)75%的乙醇，所以含有一定量的水，一部分的氫化肉桂酸乙酯就析出殘留到蜂膠渣中。且蜂膠渣揮發(fā)性成分中不含有酸類化合物，是由于經(jīng)過乙醇提取后，大量的酸與醇類化合物發(fā)生酯化反應。

3 結語

通過對蜂膠原膠、蜂膠乙醇提取液及蜂膠渣中揮發(fā)性成分的分析與比較發(fā)現(xiàn)，利用乙醇浸提法制備蜂膠酊的加工工藝中，經(jīng)乙醇提取后剩余的蜂膠渣中還有一部分殘留的揮發(fā)性物質(zhì)，且它們的色澤、性質(zhì)與蜂膠原膠中的揮發(fā)性物質(zhì)相同。經(jīng)分析得知，蜂膠渣中的揮發(fā)性物質(zhì)中含有大量與原膠揮發(fā)性物質(zhì)相同物質(zhì)如萜烯類化合物。可以考慮在以下方面提高蜂膠的利用價值:（1）利用蜂膠渣提取具有功能效益的蜂膠精油；（2）蜂膠渣乙醇提取時發(fā)生酯化反應衍生出3-苯丙酸乙酯、這種物質(zhì)可用作醫(yī)藥中間體，制得生物制劑，也用于有機合成。所以可考慮利用蜂膠渣提取3-苯丙酸乙酯；（3）在利用蜂膠渣進行揮發(fā)性成分開發(fā)過程中可適當改善蜂膠醇提工藝，減少揮發(fā)性物質(zhì)的損失，以保存更多低沸點易揮發(fā)的萜烯類化合物及萜類含氧衍生物，從而保證揮發(fā)性成分的性狀。

表2 蜂膠原膠、蜂膠乙醇提取液及蜂膠渣中的主要揮發(fā)性物質(zhì)Tab.2 Main volatile substances in the raw material，PEES and DPEES

續(xù)表1

[1]Bankova V S，Castro S L，Marcucci M C.Propolis:recent advances in chemistry and plant origin[J].Apidologie，2000，31（1）:3-15.

[2]Kismet K，Kilicoglu B，Koru O，et al.Evaluation on scolicidal efficacy of propolis[J].European Surgical Research，2006，38（5）:476-481.

[3]Wollenweber E，Hausen BM，Greenaway W.Phenolic constituents and sensitizing properties of propolis，poplar balsam and balsam of Peru[J].Bulletin de Groupe Polyphenol，1990，15:112-120.

[4]Sahinler N，Kaftanoglu O.Natural product propolis:chemical composition[J].Natural Product Research，2005，19（2）:183-188.

[5]Marcucci M C.Propolis:chemical composition，biological properties and therapeutic activity[J].Apidologie，1995，26（2）:83-99.

[6]Burdock G A.Review of the biological properties and toxicity of bee propolis （propolis）[J].Food and Chemical Toxicology，1998，36（4）:347-363.

[7]Stefano C，F(xiàn)rancesco C.Propolis，an old remedy used in modern medicine[J].Fitoterapia，2002，73（Suppl）:S1-S6.

[8]ZHOU Jin-hui，LI Yi，ZHAO Jing.Geographical traceability of propolis by high-performance liquid-chromatography fingerprints[J].Food Chemistry，2008，108（2）:749-759.

[9]Feng Li，Suresh Awale，Yasuhiro Tezuka.Study on the constituents of Mexican propolis and their cytotoxic activity against PANC-1 human pancreatic cancer cells[J].J Nat Prod，2010，73（4）:623-627.

[10]Chen Y J，Huang A C，Chang H H，et al.Caffeic acid phenethyl ester，an antioxidant from propolis，protects peripheral blood mononuclear cells of competitive cyclists against hyperthermal stress[J].Journal of Food Science，2009，74（6）:162-167.

[11]Arjun H，Banskota，Yasuhiro T，et al.Recent progress in pharmacological research of propolis[J].Phytotherapy Research，2001，15（7）:561-571.

[12]GOmez-Caravaca A M，GOmez-Romero M，Arráez-Román D，et al.Advances in the analysis of phenolic compounds in products derived from bees[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2006，41（4）:1220-1234.

[13]Sahinler N，Kaftanoglu O.Natural product propolis:chemical composition[J].Natural Product Research，2005，19（2）:183-188.

[14]Viuda-Martos M，Ruiz-Navajas Y，F(xiàn)ernández López J，et al.Functional properties of honey，propolis，and royal jelly[J].Journal of Food Science，2008，73（9）:117-124.

[15]Popova M，Bankova V，Butovska D，et al.Validated methods for quantification of biologically active constituents of poplar-typepropolis[J].Phytochemical Analysis，2004，15（4）:235-240.

[16]吳立軍，吳繼洲.天然藥物化[M].北京:人民藥物出版社，2004.

[17]Melliou E，stratis E，Chinou I.Volatile constituents of propolis from various regions of Greece-antimicrobial activity[J].Food Chemistry，2007，103（2）:375-380.

[18]李雅潔，凌建亞，鄧永.蒙山蜂膠超臨界二氧化碳萃取揮發(fā)性組分的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析 [J].時珍國醫(yī)國藥，2006，7（10）:1975-1976.LI Ya-jie，LING Jian-ya，DENG Yong.Supercritical carbon dioxide extraction of essential oil from propolis of mount Meng and analysis by GC-MS[J].Lishizhen Medicine and Materia Medica Research，2006，7（10）:1975-1976.（in Chinese）

[19]胡福良.蜂膠藥理作用研究[M].杭州:浙江大學出版社，2005.

[20]呂澤田.蜂膠市場:2010年的基本情況與2011年的初步預測[J].蜜蜂雜志，2011，31（4）:12-14.LV Ze-tian.The propolis market:the basic information in 2010 and preliminary forecasting in 2011[J].Journal ofBee，2011，31（4）:12-14.（in Chinese）

[21]滑艷，鄧雁如，汪漢卿.精油的藥理活性及醫(yī)學用途[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2003，14:467-470.HUA Yan， DENG Yan-ru，WANG Han-qin.Pharmacological activity and uses in medical science of essential oils[J].Natural Product Research and Development，2003，14:467-470.（in Chinese）

[22]Santosh K.Katiyar，Rajesh Agarwal，Hasan Mukhtar.Inhibition of tumor promotion in SENCAR mouse skin by ethanol extract of Zingiber officinale rhizome[J].Cancer Res，1996，56:1023-1030.

[23]張翠平，胡福良.蜂膠中的黃酮類化合物[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2009，21（6）:1084-1090.ZHANG Cui-ping，HU Fu-liang.Flavonoids in propolis[J].Natural Product Research and Development，2009，21（6）:1084-1090.（in Chinese）

[24]李文，谷鎮(zhèn)，楊焱，等.黃牛肝菌中揮發(fā)性成分的GC-MS分析[J].食品與生物技術學報，2012，31（8）:871-878.LI Wen，GU Zhen，YANG Yan，et al.Analysis of volatile components of boletus auripes PK.by GC-MS[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2012，31（8）:871-878.（in Chinese）