酒酒球菌31MBR的β-D-葡萄糖苷酶活性

李亞輝， 崔禾苗， 董 梅， 樊明濤

（西北農林科技大學 食品學院，陜西 楊凌 712100）

優(yōu)質葡萄酒不僅表現(xiàn)在外觀、口感等方面，更體現(xiàn)在香氣方面，香氣是影響葡萄酒質量的主要因素之一[1]。葡萄漿果中存在著結合態(tài)和游離態(tài)兩大類呈香物質[2-3]。結合態(tài)呈香物質的含量比游離態(tài)呈香物質要豐富得多，并且大部分以糖苷的形式存在。結合態(tài)呈香物質雖沒有香氣，但經過分解可以釋放出游離態(tài)香氣物質，大大增強和改善葡萄酒的風味[4-5]，因此結合態(tài)呈香物質又被稱為風味前體物質是葡萄酒香氣的一個重要來源。葡萄酒中糖苷類物質的分解主要分為弱酸水解和酶促水解[6-8]。酸解發(fā)生緩慢，對溫度、pH等均有嚴格的要求，且會影響釋放出物質的性質，產生不良風味[9-10]，因此不適于在葡萄酒釀造工業(yè)中應用。而酶解則是一種接近于自然、溫和的水解方法，極具商業(yè)化應用前景。在葡萄酒釀造中一般采用酶解的方法來分解風味前體物質增強葡萄酒香氣[9，11-12]。糖苷類物質的酶解需要多種酶的共同參與，其中β-D-葡萄糖苷酶是結合態(tài)香氣釋放的關鍵酶[3]。

微生物中β-D-葡萄糖苷酶酶活高的菌株主要是霉菌[13]，而乳酸菌中也有一些菌株具有較高的糖苷酶活性。酒酒球菌31MBR是在我國廣泛應用的一株商業(yè)葡萄酒釀造乳酸菌，具有良好的蘋果酸乳酸發(fā)酵性能。但目前關于該菌β-D-葡萄糖苷酶活性的研究還未見報道。作者對酒酒球菌31MBR進行了β-D-葡萄糖苷酶活的定位測定、不同生長時期酶活的測定以及酶的誘導測定。這對開發(fā)酒酒球菌31MBR的新功能，增強葡萄酒的香氣、提高中國地區(qū)葡萄酒的品質具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酒酒球菌31MBR:西北農林科技大學葡萄酒學院微生物實驗室保藏。

對-硝苯-β-葡萄糖苷（p-NPG）:美國 Sigma公司；葡萄糖、纖維二糖、熊果苷:美國 Amersc公司；其他試劑均為西隴化學試劑。

ATB培養(yǎng)基:蛋白胨 10 g/L，酵母浸粉 5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L， 葡萄糖 10 g/L，MnSO4·4H2O 0.05 g/L，鹽酸半胱氨酸 0.5 g/L，番茄汁 250 ml/L，pH值調至4.8，121℃滅菌20 min。

DH-420A電熱恒溫培養(yǎng)箱:北京科偉永興儀器有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機:安徽中科中佳科學儀器有限公司；HS-840μ型水平層流單人凈化工作臺:蘇州凈化設備有限公司；UV-3802H紫外可見分光光度儀:上海尤尼柯儀器有限公司；VC-130超聲波細胞破碎儀:美國Sonics&Materials公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化及生長曲線測定 將冷凍保藏的31MBR菌株于ATB培養(yǎng)基中25℃靜置培養(yǎng)，然后在同樣培養(yǎng)基中再轉接2次，分別培養(yǎng)2 d。將活化好的菌懸液以1%接種體積分數轉接至100 mL ATB培養(yǎng)基中，25℃靜置培養(yǎng)，每隔4 h測定一次OD600值，直至OD600值穩(wěn)定。

1.2.2 β-D-葡萄糖苷酶活測定方法 酶活測定方法參照Barbagallo[14]略作修改。0.5 mL處理樣品與0.5 mL 2×底物磷酸檸檬酸緩沖液（pH 5.0，p-NPG 5 mmol/L）混合均勻，30℃水浴反應1 h，離心10 min（4℃，10 000 g）得上清液，上清液中加入2 mL Na2CO3（1 mol/L）終止反應，最后在400 nm下比色。標準曲線由不同濃度（0～200 μmol/L）的對硝基苯酚（p-NP）與 Na2CO3（1 mol/L）混合在 400 nm 下比色獲得。菌體干重由50 mL菌液離心、烘干、稱重獲得。酶活單位定義為:p-NP μmol/（g·min）。

1.2.3 31MBR不同部位酶活的測定 將酒酒球菌31MBR培養(yǎng)至36 h（對數生長末期），按下列步驟分別獲得菌液上清液、完整細胞、細胞破碎液上清液和細胞破碎液沉淀4個處理樣品。取1 mL菌液離心10 min（4℃，5 000 g），得菌體和培養(yǎng)基上清液。菌體用NaCl（150 mmol/L）洗滌兩次得完整細胞。完整細胞懸浮于1 mL PBS buffer（NaCl 140 mmol/L；KCl 2.7 mmol/L；Na2HPO410 mmol/L；KH2PO41.8 mmol/L；pH 7.4），超聲波 100 W 破碎 10 min，然后離心10 min（4℃，10 000 g）得破碎上清液和破碎沉淀。按照1.2.2方法分別測不同樣品的酶活。

1.2.4 31MBR不同生長階段酶活的測定 分別在對數生長中期（20 h）、對數生長末期（36 h）和穩(wěn)定期（50 h）取樣，按照1.2.3方法分別測菌液上清液、完整細胞和細胞破碎液酶活。

1.2.5 31MBR葡萄糖苷酶的誘導測定 分別以葡萄糖（10 g/L）、纖維二糖（10 g/L）、熊果苷（10 g/L）、葡萄糖（5 g/L）加熊果苷（5 g/L）和葡萄糖（5 g/L）加纖維二糖（5 g/L）作為培養(yǎng)基中的碳源，培養(yǎng)酒酒球菌31MBR至對數生長末期（36 h），按照1.2.3方法分別測菌液上清液、完整細胞和細胞破碎液的酶活。

2 結果與分析

2.1 酒酒球菌31MBR生長曲線

由圖1可知，8～36 h為31MBR的對數生長期，36 h之后為穩(wěn)定期。因此作者分別在20 h（對數生長中期）、36 h（對數生長末期）和 50 h（穩(wěn)定期）取樣測定31MBR不同生長時期的酶活。

圖1 31MBR生長曲線Fig.1 Growth curve of 31MBR

2.2 31MBR不同部位的酶活

圖2顯示了酒酒球菌31MBR的β-D-葡萄糖苷酶定位測定結果。菌液上清液中酶活很低，幾乎為零，說明在31MBR生長過程中分泌到胞外的β-D-葡萄糖苷酶很少，該酶不是胞外酶。細胞破碎后，細胞結構被破壞，酶蛋白釋放出來，離心得到的上清液和沉淀中均有酶活，說明β-D-葡萄糖苷酶主要為胞內酶。而破碎液上清中的酶活顯著高于沉淀中的酶活，說明了胞內的β-D-葡萄糖苷酶為可溶性的非膜結合酶，而另一部則可能是膜結合酶。值得注意的是，31MBR的完整細胞也具有一定的酶活，這可能是細胞通過磷酸烯醇式丙酮酸轉移酶系統(tǒng)來實現(xiàn)的[15-17]。完整細胞具有β-D-葡萄糖苷酶活對于葡萄酒釀造具有重要意義，可以使該乳酸菌在實現(xiàn)降酸的同時，進一步釋放結合態(tài)的風味物質，改善葡萄酒的香氣。

圖2 31MBR β-D-葡萄糖苷酶活定位Fig.2 Enzyme localization of 31MBR

2.3 31MBR不同生長階段的酶活

圖3顯示了31MBR菌液上清液、完整細胞和細胞破碎液在對數生長中期（20 h）、末期（36 h）和穩(wěn)定期（50 h）的酶活。由圖3可知，菌液上清液在三個不同時期的酶活都幾乎為零，這和結果2.2一致，說明該酶不是胞外酶，且酶的位置沒有隨著生長時期的變化而發(fā)生變化。同時可以看出，完整細胞和破碎液的酶活在對數生長中期最高，且隨著生長時間的延長呈下降趨勢。

圖3 31MBR不同生長階段酶活Fig.3 Enzyme activity at different period of 31MBR

2.4 31MBR糖苷酶的誘導

微生物來源的糖苷酶除了是結構酶外，還可能是在碳源誘導下產生的誘導酶。圖4顯示了31MBR β-D-葡萄糖苷酶在不同碳源誘導下的實驗結果。由圖4可知，在有熊果苷作為碳源時菌液上清液的酶活顯著高于其他試驗組的酶活。這是因為熊果苷在分解產生葡萄糖的同時產生了對羥基苯酚，和對硝基苯酚一樣在堿性條件下產生黃色而造成酶活測定結果較高。菌液上清液在不同試驗組中較低的酶活和酶活定位的結果一致，說明了糖苷酶的位置沒有隨著碳源的變化而發(fā)生變化。

圖4 31MBR β-D-葡萄糖苷酶的誘導Fig.4 Induction of β-D-glucosidase activity from 31MBR

對于細胞破碎液來說，以葡萄糖作為碳源時有較高的酶活，這說明了31MBR的胞內β-D-葡萄糖苷酶是結構酶。但在有纖維二糖或熊果苷作為碳源時其酶活顯著高于以葡萄糖作為碳源時的酶活，且有熊果苷作為碳源時的酶活要高于有纖維二糖作為碳源時的酶活，說明在含糖苷鍵碳源的誘導下酶活會有不同程度的提高。這種現(xiàn)象可能是葡萄糖代謝產物的阻遏作用造成的。完整細胞呈現(xiàn)出和破碎液完全一樣的趨勢。

3 結語

酒酒球菌31MBR的β-D-葡萄糖苷酶為胞內酶，且主要為可溶性的非膜結合酶。31MBR的完整細胞具有一定的酶活，對于葡萄酒釀造具有重要意義。31MBR的β-D-葡萄糖苷酶位置不隨生長時期和碳源的變化而發(fā)生變化。酶活在對數生長中期最高且隨著生長時間的延長呈下降趨勢。該酶為結構酶，但在纖維二糖和熊果苷的誘導下酶活有不同程度的提高。

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