黑加侖花色苷抗禽白血病A亞群病毒作用

雷用東， 王 丹， 童軍茂， 張 莉， 馬 越， 張 超， 趙曉燕*

（1.北京市農林科學院 蔬菜研究中心，北京 100097；2.石河子大學 食品學院，新疆 石河子 832003）

黑加侖（Blackcurrant），拉丁名 Ribes nigrum L.，學名黑穗醋栗，在我國東部地區廣泛種植[1]。研究發現，黑加侖花色苷提取物 （Anthocyanins from Blackcurrant，ACB）具有抑制肝細胞癌[2]，清除自由基和抑制胃癌細胞增殖[3]，減少動脈粥樣硬化血栓的形成，抗炎癥[4]和抗疲勞作用[5]等功能。禽白血病是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）引起的以造血細胞惡性增生為主的一類傳染病。目前ALV 分為A～J 10個亞群，A、B、C、D為外源性病毒，E為內源性病毒[6]。近年來，在我國不同規模的養雞場中，由雞群中經典外源性ALV-A感染而引起的惡性腫瘤的病例顯著上升，已給養殖業造成了很大經濟損失[7]。因此，作者在結合國內外對ACB的抗癌功能研究的基礎上，采用細胞模型，通過ACB對ALV-A誘導的DF1細胞形態學變化及細胞存活情況的影響，在體外開展其抗病毒活性的研究。本研究結果為ACB預防ALV-A病毒藥物的開發提供理論依據，并為人類預防白血病病毒提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

黑加侖花色苷粉:購自北京綠色金可生物技術股份有限公司；DF1細胞、ALV-A病毒:由北京市農林科學院畜牧所提供；高糖DMEM培養基:購自Hyclone公司；胎牛血清（FBS）:購自澳大利亞Gibco公司；胰蛋白酶:購自美國 BD 公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽 （MTT）、二甲基亞砜（DMSO）:購自 Sigma 公司；鹽酸阿霉素（DOX）:上海生工；其余試劑均為國產分析純。

液質聯用儀（HPLC 1200系列，MS 6310系列）:Agilent公司；超凈工作臺YT-CJ-2NB:北京亞泰克隆實驗科技開發中心；倒置生物顯微鏡BDS200:OPTEC奧特光學；CO2水套式培養箱:Thermo公司；細胞自動計數分析儀CYT-100:CYTORECON公司；酶標儀550:Bio Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑加侖花色苷的主要成分分析

1）樣品制備:ACB粉首先用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋成質量濃度為1 mg/mL母液，0.22 μm針式過濾器過濾，-20℃保存備用。

2）HPLC分析條件:紫外檢測器，波長:520 nm；流動相:A 5%甲酸水溶液，B 100%乙腈；分離柱:C18（4.6 mm ×150 mm，5 μm）。進樣量 5 μL，流速 1 mL/min，柱溫25℃，梯度洗脫程序為:0～8 min，13%～22%B；8 ～15 min，22% ～23%B；15 ～20 min，23% ～100%B；20～25 min，100%B；25～26 min，100%～13%B；26～33 min，13%B。

3）MS分析條件:采用正離子模式，掃描范圍為100～1 500（m/z）；N2流速為 12 L/min；噴霧器壓力為310 kPa；干燥氣溫度為350℃。

1.2.2 細胞培養 參照文獻[8]所描述的細胞培養方法，按體積比10∶1的胎牛血清與高糖DMEM培養基混合，在37℃、體積分數為5%的CO2培養箱中對DF1細胞常規培養，隔天傳代，調整細胞生長狀態，一般以傳代數為3～6生長良好的細胞，進行實驗。

1.2.3 黑加侖花色苷對DF1的毒性試驗 為了解ACB對DF1的細胞毒性，采用常規MTT實驗方法[9]，取生長良好的DF1細胞（細胞懸浮濃度為2～3×105 cells/mL），每孔 200 μL，接種于 96 孔細胞培養板內，置于5%CO237℃培養24 h后，對照組不加ACB，樣品組每孔內分別加入ACB使其終質量濃度分別為 2、4、6、8、10、12、14 μg/mL，每個濃度設 6 個平行孔，然后置于培養箱內，分別在 24、48、72、96 h后，棄除培養液，每孔內分別入MTT溶液10 μL，37℃繼續孵育4 h后，終止培養，棄除上清液后，每孔加入170 μL二甲基亞砜，微量振蕩10 min，使MTT還原產物完全溶解，用酶標儀在490 nm處測定對照組和樣品組各孔吸光度（OD）值，通過OD值的大小間接反應ACB的細胞毒性。

1.2.4 黑加侖花色苷體外抗ALV-A活性試驗

1）黑加侖花色苷體外的預防病毒試驗:按照1.2.3 ACB對DF1的毒性試驗方法，取生長良好的200 μL細胞懸液，置于96孔細胞培養板內，約80%形成單層細胞，棄生長液，向孔中加入樣品稀釋后的樣品母液，使其終質量濃度為 2、4、6、8、10 μg/mL，37℃孵育1 h后，加入20 μL ALV-A病毒液再孵育1 h，2%FBS的細胞維持液每孔補至200 μL。分別在24、48、72、96 h后， 采用 MTT法在 490 nm 測定OD值。試驗設細胞對照、病毒對照和阿霉素對照，6個平行孔，3次重復實驗。

2）黑加侖花色苷體外的治療病毒試驗:同1.2.3方法，準備4個DF1長成約80%單層細胞的96孔板，棄生長液，每孔加20 μL ALV-A病毒液，37℃孵育1 h后，向孔中加入樣品母液，使其終質量濃度分別為 2、4、6、8、10 μg/mL， 細胞維持液補液體至200 μL。 分別培養至 24、48、72、96 h 后，采用 MTT法在490 nm測定OD值。

1.2.5 黑加侖花色苷與ALV-A對DF1細胞形態學試驗 按照1.2.4實驗方法，取生長良好的DF1細胞（細胞懸浮濃度為 5～7×105cells/mL），接種于 25 cm2細胞培養瓶中，置于5%CO2、37℃培養箱培養成單層，棄生長液，加入500 μL ALV-A病毒液，37℃孵育1 h后，向孔中加入ACB母液，使其終質量濃度分別為2 μg/mL和8 μg/mL，細胞維持液補液體至5 mL。試驗設細胞對照、病毒對照和治療對照。

1.2.6 數據統計分析 本實驗結果數據采用Origin8軟件作圖、Agilent ChemDF1ation Rev.A.09.01 software和DPS統計軟件分析，數據均以平均數和標準偏差（±SD）表示，采用 Duncan 新復極差多重比較。

2 結果與分析

2.1 黑加侖花色苷的HPLC-MS成分分析

黑加侖花色苷的HPLC色譜圖見圖1。

圖1 黑加侖主要花色苷的HPLC色譜圖（520 nm）Fig.1 HPLC profiles（520 nm） of the major anthocyanins from Blackcurrant

由圖1可知，黑加侖主要含兩種成分。作者鑒定出兩種花色苷，見表1，與文獻[10]鑒定花色苷組分相似，飛燕草及矢車菊素類花色苷為其主要成分。然而與前人研究結果不同的是，作者未檢測出天竺葵色素類花色苷，可能是黑加侖的品種、采收時間及其種植地域等因素導致。

表1 黑加侖中主要的花色苷成分Table 1 Major anthocyanin components of Blackcurrant

2.2 黑加侖花色苷對DF1細胞毒性的研究

研究不同質量濃度的ACB對DF1單層細胞的毒性作用。從表2可以看出:細胞對照組在72 h與96 h的OD值大小一致，無顯著水平差異，說明96 h時為細胞生長達到最大程度的時間值。同一時間段下，當在質量濃度小于10 μg/mL各處理組，隨著ACB質量濃度的增加，OD值均比對照組高或者無水平差異，具有量效依賴性，說明ACB對 DF1細胞的生長有促進作用或者無毒性作用；當ACB質量濃度高于10 μg/mL，各處理組OD值與細胞對照相比，OD值呈下降趨勢，DF1生長受到不同程度抑制，有顯著性差異，差異具有統計學意義。在24、48、72、96 h四個時間段中，質量濃度小于10 μg/mL各處理組均顯著高于對照組，但是在時間上的水平差異并不顯著。本研究體外試驗時加入ACB，對正常DF1細胞的有無細胞毒性作用，當ACB質量濃度大于10 μg/mL時，各細胞組存活情況顯著下降，說明10 μg/mL是ACB對DF1細胞無細胞毒性的最大安全質量濃度。賈娜等[11]研究證實黑加侖花色苷具有清除自由基能力，推測ACB能清除細胞產生有害物質，因此一定質量濃度范圍內ACB可能提高了DF1細胞機能，從而促進其生長。

2.3 黑加侖花色苷體外抑制ALV-A活性的研究

阿霉素（DOX）為常見的抗腫瘤藥細胞毒類藥物，對白血病有明顯的治療效果[12]。本試驗前期已探討出DOX質量濃度為200 ng/mL對禽白血病A亞群有良好的治療效果，為本研究作為很好的藥物對照樣品。本實驗在ACB對DF1生長影響的最大質量濃度在10 μg/mL范圍內，展開對ACB抗ALV-A活性的研究。

表 2 ACB 對 DF1 細胞毒性（±s，n=6）Table 2 Cytotoxicity of ACB on DF1 cell（±s，n=6）

表 2 ACB 對 DF1 細胞毒性（±s，n=6）Table 2 Cytotoxicity of ACB on DF1 cell（±s，n=6）

注：采用Duncan新復極差多重比較法分析，不同字母表示每行時間之間的5%顯著水平差異，斜體字母表示每列質量濃度之間的5%顯著水平差異。

質量濃度/（μg/mL）2448時間/h 7296 0 2 4 6 8 1 0 12 14 0.591±0.026bbc 0.681±0.036ca 0.664±0.006aab 0.648±0.056cab 0.689±0.076ba 0.596±0.022bbc 0.523±0.013cc 0.433±0.063bd 0.860±0.049aa 0.868±0.031ba 0.861±0.046ba 0.840±0.040ba 0.867±0.052aa 0.845±0.022aa 0.728±0.028ab 0.667±0.021ab 0.902±0.059aa 0.893±0.025aba 0.880±0.044aba 0.928±0.029aa 0.931±0.040aa 0.872±0.042aa 0.680±0.038ab 0.512±0.062cc 0.914±0.043aa 0.952±0.074aa 0.964±0.051aa 0.952±0.024aa 0.959±0.026aa 0.905±0.029aa 0.629±0.064bb 0.420±0.013bc

2.3.1 黑加侖花色苷對ALV-A的預防試驗結果研究ACB對ALV-A的預防作用，即向DF1單層細胞預先加入ACB，再加入ALV-A感染細胞，起到預先防治作用。從表3可以看出，在各時間段下，藥物阿霉素對照的OD值均高于病毒組，有顯著性差異，說明阿霉素對ALV-A起到了治療作用。同一時間下，ACB各質量濃度處理組的DF1細胞OD值均顯著高于病毒對照組，具有量效依賴關系。其中72 h時，添加ACB質量濃度8 μg/mL的OD值為0.874，明顯高于病毒對照OD值0.789，有顯著性差異，說明在體外ACB質量濃度8 μg/mL對ALV-A病毒有一定的預防作用。在作用時間效應上，ACB對ALV-A抑制作用也比較明顯，但是在同質量濃度間差異性比較小。本實驗結果表明:ACB各質量濃度處理對ALV-A的具有預防作用，可明顯抑制ALVA在DF1細胞上的增殖。陶欣藝等[13]研究表明，花色苷能抑制氧化應激誘導的神經細胞凋亡，ACB可能通過提高細胞機體內的抗氧化酶類活性，減少由有害因素引起自由基的增加，從而減慢ALV-A在宿主細胞上的增殖。

表3 不同質量濃度ACB體外對ALV-A的預防效果Table 3 Influence of prevention on ALV-A under different concentration of ACB in vitro

2.3.2 黑加侖花色苷對ALV-A的治療試驗結果研究ACB對ALV-A的治療作用，即加入ALV-A預先感染DF1單層細胞后，再用ACB處理，起到治療作用。從表4可以看出，阿霉素藥物治療對照組的各OD值均高于病毒組，治療效果明顯；同一時間下，ACB各質量濃度處理組的OD值均顯著高于ALV-A病毒對照組，隨著ACB質量濃度增加，其OD值逐漸上升，差異顯著，呈量效依賴關系。其中在72 h時，ACB質量濃度8 μg/mL時的OD值為0.843，與ALV-A病毒對照的OD值為0.753，呈顯著性差異。因此，在體外ACB對ALV-A病毒具有一定的治療作用。

表4 不同質量濃度ACB體外對ALV-A的治療效果Table 4 Influence of treatment on ALV-A under different concentration of ACB in vitro

作者研究發現，ACB對ALV-A的預防作用比治療作用明顯。在相同質量濃度下，預防試驗的OD值比治療試驗的高，結果見表3，4。提示ACB對ALV-A的預防作用比治療作用顯著，推測這可能與細胞性繼發作用有關[14]。運用ACB進行干擾溶酶體膜通透性，減緩細胞自溶速度，從而保護正常細胞。因此，給家禽添加適量ACB的飼養，能增強機體的抗病毒能力，對ALV-A起到早期預防作用。

2.4 黑加侖花色苷與ALV-A對DF1細胞形態學的影響

觀察發現，DF1單層細胞感染ALV-A病毒后，一般在5 d左右出現比較明顯的病變，表現為細胞脫落、形態改變，或形成病斑。正常DF1形成單層細胞后，細胞呈長梭形或扁平星形，大小均勻[15]。生長至5 d，采用倒置顯微鏡圖顯示:圖2a為正常DF1細胞對照，細胞形態較為完整，有部分細胞脫離單層，是由于培養5 d后其營養物質的消耗和有害代謝產物積累而導致；圖2b顯示ACB質量濃度為8 μg/mL處理正常細胞，單層細胞表面完整，折光性好，無空隙，很少破碎死亡，細胞生長狀態良好；圖2C為DF1細胞受ALV-A病毒感染，出現明顯細胞形態完全改變，空泡化，大部分細胞已經脫離單層，發生嚴重的病變；圖2d為阿霉素藥物對照，只有少量細胞脫離單層，細胞形態較為完整；圖2e為ACB質量濃度2 μg/mL作用于ALV-A誘導的DF1形態，結果顯示有細胞脫離單層，細胞間隙增加，占70%的細胞保持單層狀態；圖2f顯示ACB質量濃度8 μg/mL作用于ALV-A誘導的DF1形態，細胞有部分脫落，約80%的細胞保持單層狀態，與圖2E比較，其細胞形態較好。因此，ACB能保護DF1的細胞形態，對ALV-A病毒繁殖有一定的抑制作用。

圖2 ACB對DF1細胞形態的影響（×250）Fig.2 Effect of ACB on DF1 cell morphology under microscope （× 250）

3 結語

目前我國對花色苷類作為抗病毒藥物的研究相對比較薄弱，主要集中在花色苷抗腫瘤的研究上，對禽白血病病毒的系統研究還不夠深入，對花色苷抗病毒的藥理作用研究才處于起步階段。作者通過研究表明，黑加侖含有飛燕草色素-3-鼠李糖苷-5-葡萄糖苷和矢車菊色素-3-鼠李糖苷-5-葡萄糖苷兩種主要花色苷成分；黑加侖花色苷在體外具有一定的抑制禽白血病A亞群病毒增殖作用，并隨劑量的增大呈量效依賴關系，同時對DF1細胞抵抗力有明顯的增強作用。作者用黑加侖花色苷混合物進行抗病毒研究，其抗病毒效果其含有的花色苷種類有關，具體哪種花色苷單體或者花色苷復合物起作用更佳，其確切機制還有待于深入研究。

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