酶解水提法從胡蘿卜中提取水溶性β-胡蘿卜素

張瑋瑋 ， 武彥文 ， 歐陽杰 *

（1.北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100083；2.林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室，北京林業(yè)大學(xué)，北京100083；3.北京市理化分析測試中心，北京100089）

類胡蘿卜素是廣泛存在于植物中的一大類天然色素，其可用作藥品、膳食補充劑或食品添加劑。作為天然食用色素，類胡蘿卜色素被廣泛用于飲料、焙烤食品、人造黃油、奶酪、和肉制品等。類胡蘿卜素新的生物學(xué)功能包括激活編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物信息的基因以及調(diào)節(jié)脂氧和酶活力、降低心血管疾病風(fēng)險以及加強艾滋病患者的免疫標(biāo)志等[1]。類胡蘿卜素由八個異戊二烯單位相連而成，當(dāng)吸收了光能的時候，相連雙碳鍵的電子容易被激活而使其結(jié)構(gòu)受到破壞[2]。自然界的類胡蘿卜素常以共價鍵或者微弱的關(guān)系與蛋白質(zhì)結(jié)合而形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而保護它免受氧化或其它因素的降解并且影響著其顏色[3]。已經(jīng)確定了類胡蘿卜素復(fù)合體存在于無脊椎動物[4-6]，水藻[7]和藍細菌[8-10]中。目前對于類胡蘿卜素-蛋白質(zhì)復(fù)合物研究較多的是植物細胞葉綠素內(nèi)類胡蘿卜素以及動物細胞內(nèi)蝦青素，包括復(fù)合物的存在形式和作用機制等。Bryant等人通過對胡蘿卜中的色素細胞進行溶解、分離以及凝膠過濾，最后得到了一種包含α-和β-類胡蘿卜素的胡蘿卜素蛋白，并證明其色素蛋白復(fù)合物相對分子質(zhì)量超過兩百萬，同時證明了由于色素和蛋白質(zhì)結(jié)合，使得其吸收譜圖和其在水中的溶解性發(fā)生了變化[11]。Britton等人證明了蝦青素蛋白的亞單位由兩個蝦青素分子和兩個β-甲殼藍蛋白結(jié)合而成，結(jié)合后的色素蛋白呈現(xiàn)其特有的青色[12]。

胡蘿卜肉質(zhì)根中含有多種類胡蘿卜素，不同顏色品種含有的類胡蘿卜素不同。白色類型不含色素，黃色類型主要含有黃色色素，特別是葉黃素，橘色類型主要含有α-和β-胡蘿卜素，紅色類型主要含有番茄紅素和β-胡蘿卜素，紫色類型含有多種花青素，α-和β-胡蘿卜素[13]。從植物原料中提取類胡蘿卜素的方法主要采用有機溶劑提取的方法，提取出來的油溶性類胡蘿卜素在生物體外非常不穩(wěn)定，在光、熱、堿等條件下容易降解。因此如何能從植物細胞中提取穩(wěn)定性較好、呈自然狀態(tài)的類胡蘿卜素-蛋白質(zhì)復(fù)合物值得關(guān)注。迄今為止，利用纖維素酶和果膠酶破壞植物細胞壁提取類胡蘿卜素的研究較少。Barzana等人向金盞花中加入果膠酶、中性蛋白酶以及H-蛋白水解酶的方法，得到了得率高于85%的類胡蘿卜素[14]；Mannel等人利用非商業(yè)酶從紅辣椒中提取辣椒素和類胡蘿卜素，得率分別為96%和85%[15]；Navarrete-Bolanos等人利用非商業(yè)酶制劑從金盞花中提取葉黃素，得率為29.3 g/kg[15]。同時超聲波也能起到幫助破碎細胞壁的作用，并且超聲波輔助提取技術(shù)具有節(jié)省成本、提取速度快、工藝可行等特點[17]，因此在提取過程中可以考慮通過超聲輔助破壁的方法提高提取率。趙錫蘭在利用超聲波浸取法提取枸杞中類胡蘿卜素方法優(yōu)化中證明了超聲波浸取法簡單、提取、提取收益高的特點，適用于植物中類胡蘿卜素的提取[18]。本研究通過對纖維素酶用量、果膠酶用量、酶解時間、酶解pH、酶解溫度以及超聲波輔助破碎細胞的時間等因素進行單因素實驗和響應(yīng)面分析，從而得出酶解水提法從胡蘿卜中提取水溶性β-胡蘿卜素-蛋白質(zhì)復(fù)合物的較優(yōu)工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鮮胡蘿卜:購自北京農(nóng)貿(mào)市場。

β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品:購自Sigma公司；纖維素酶（1 059 U）、果膠酶（100 U）:購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；正己烷、吐溫-80:均為分析純，北京化學(xué)試劑公司。

752 SPECTROPHOTO METER:上海美譜達儀器有限公司；雷磁 PHS-3C pH計:上海精密科學(xué)儀器有限公司；JAC-IV型超聲波細胞破碎儀:濟寧市奧波超聲波電氣有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線 稱取0.013 g β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品，溶于正己烷，定容至500 mL容量瓶中，制得26 μg/mL的β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取 4、7、9、12、14 mL 標(biāo)準(zhǔn)液， 用正己烷定容至 50 mL，于450 nm處測吸光值，以正己烷為空白，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線為 OD450nm=0.135 6c+0.004，R2=0.999，其中c為β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度，單位是μg/mL。本實驗在計算水溶性β-胡蘿卜素提取率時，以油溶β-胡蘿卜素計算，所計算結(jié)果為β-胡蘿卜素－蛋白質(zhì)復(fù)合物中的色素部分，見圖1。

1.2.2 從胡蘿卜中提取水溶性β-胡蘿卜素的方法每組實驗取鮮胡蘿卜50 g，切碎、打漿，再加入100 mL 0.2 g/100 mL的吐溫-80溶液，加入適量纖維素酶和果膠酶，經(jīng)超聲波破碎后，調(diào)節(jié)pH值，于一定溫度下攪拌一定時間，加入2 g硅藻土，抽濾，測定濾液在450 nm下的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出提取率。

提取率 （μg/g）=（OD450nm-0.004）×濾液體積/0.135 6×50

圖1 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of β-carotene

1.2.3 單因素實驗 進行單因素實驗，其中果膠酶的用量分別為 0.1、0.2、0.4、0.5、1.0、1.5、2.0 g， 纖維素酶的用量分別為 0.1、0.2、0.3、0.4、1.0、1.5、2.0 g，酶解時間分別為 1、2、3、4、6、8、10 h，超聲波輔助破碎時間分別為 0、10、20、30、40、50、60 min，酶解 pH分別為 4.0、4.3（未調(diào)）、5.0、6.0、7.0，酶解溫度分別為 30、35、40、45、50 ℃。

1.2.4 響應(yīng)面分析因素水平的選取 采用三因素三水平設(shè)計，因素A為果膠酶用量，3個水平分別為0.3、0.4、0.5 g； 因素 B為酶解 pH，3個水平分別為5.5、6.0、6.5；因素C為超聲波時間，3個水平分別為30、40、50 min，見表 1。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface quadratic model

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠酶用量對提取率的影響

取50 g蘿卜直接打漿，加入100 mL 0.2 g/dL的吐溫-80溶液，再加入1 g纖維素酶和不同量果膠酶，攪拌24 h，加入2 g硅藻土后抽濾，計算提取率。

由圖2可知，當(dāng)果膠酶添加量較低時，色素提取率隨著果膠酶用量而增強，超過0.4 g后，提取曲線基本趨于平緩，因此，為節(jié)約提取成本，在實際提取時，應(yīng)控制果膠酶用量在0.4 g。

圖2 果膠酶用量對提取率的影響Fig.2 Effect of pectinase quantity on extraction yield

2.2 纖維素酶用量對提取率的影響

取50 g蘿卜直接打漿，加入100 mL 0.2 g/dL的吐溫-80溶液，再加入0.4 g果膠酶和不同量纖維素酶，攪拌24 h，加入2 g硅藻土抽濾，計算提取率。

由圖3可知，當(dāng)纖維素酶添加量較低時，色素提取率隨著纖維素酶用量而增強，超過1.5 g后，提取曲線基本趨于平緩，因此，為節(jié)約提取成本，在實際提取時，應(yīng)控制纖維素酶用量在1.5 g。

圖3 纖維素酶用量對提取率的影響Fig.3 Effect of cellulase quantity on extraction yield

2.3 酶解時間的影響

取50 g蘿卜直接打漿，加入100 mL 0.2 g/dL的吐溫-80溶液，再加入1.5 g纖維素酶和0.4 g果膠酶，攪拌不同時間，加入2 g硅藻土抽濾，計算提取率。

由圖4可知，酶解2 h相對于1 h提取率提高了8.95%，但是在2 h之后，提取率沒有明顯變化，因此在實際提取中，為了節(jié)省時間，將提取時間控制在2 h。

圖4 酶解時間對提取率的影響Fig.4 Effect of hydrolysation time on extraction yield

2.4 超聲波時間的影響

取50 g蘿卜直接打漿，加入100 mL 0.2 g/dL的吐溫-80溶液，再加入1.5 g纖維素酶和0.4 g果膠酶，以70 W的超聲功率超聲破碎不同時間后，攪拌提取2 h，加入2 g硅藻土抽濾，計算出提取率。

由圖5可知，在40 min以內(nèi)，提取率隨著超聲波時間的延長而增大，超過40 min之后，提取率不再增加，因此在實際的提取操作中，應(yīng)將超聲波時間控制在40 min。

圖5 超聲波時間對提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on extraction yield

2.5 酶解pH的影響

取50 g蘿卜直接打漿，加入100 mL 0.2 g/dL的吐溫-80溶液，再加入1.5 g纖維素酶和0.4 g果膠酶，分別將溶液調(diào)至不同pH，以70 W的超聲功率超聲40 min后，再攪拌提取2 h，加入2 g硅藻土抽濾，計算提取率。

由圖6可知，當(dāng)pH＜6時，提取率隨著pH增加而逐漸增加，pH為6時達到最大值，之后隨著pH的降低而降低。從現(xiàn)象上看，當(dāng)pH=8時，酶解后溶液中存在較多胡蘿卜顆粒，無法進行充分的水解破壁以及有效的抽濾提取，因此在實際的提取操作中，應(yīng)將酶解pH控制為6.0。

圖6 酶解pH對提取率的影響Fig.6 Effect of pH on extraction yield

2.6 酶解溫度的影響

取50 g蘿卜直接打漿，加入100 mL 0.2 g/dL的吐溫-80溶液，再加入1.5 g纖維素酶和0.4 g果膠酶，將溶液pH調(diào)至6.0，以70 W的超聲功率超聲40 min后，將樣品至于不同溫度的水浴鍋中，電動攪拌提取充分時間，加入2 g硅藻土抽濾，計算出提取率。

由圖7可知，酶解的最適溫度為40℃，提取率隨著溫度呈拋物線狀變化，當(dāng)溫度達到40℃時提取率最大，因此在實際的提取操作中，將提取溫度控制在40℃。

圖7 酶解溫度對提取率的影響Fig.7 Effect of hydrolysation temperature on extraction yield

2.7 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解條件

由單因素實驗發(fā)現(xiàn)，果膠酶用量、超聲波時間和酶水解pH對β-胡蘿卜素的提取率影響較大，因此對這三個因子進行響應(yīng)面分析。

2.7.1 模型方程與顯著性檢驗 對果膠酶用量A、超聲波時間B、和酶水解pH做變換如下:X1=（A-0.4）/0.1，X2=（B-6）/0.5，X3=（C-40）/10， 以 X1，X2，X3為自變量，以β-胡蘿卜素提取率為響應(yīng)值（Y），實驗方案及結(jié)果見表2，回歸方程分析結(jié)果見表3。

17個實驗分為析因?qū)嶒灪椭行膶嶒灒渲?-12組為析因?qū)嶒灒?3-17組為中心實驗，其中析因點為自變量取值在X1，X2，X3所構(gòu)成的三維定點，零點區(qū)域為中心點，零點試驗重復(fù)5次，以估計試驗誤差。采用通過Design-Expert軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合，獲得回歸方程為:Y=12.60+1.09X1+0.47X2+0.44X3+0.11X1X2－0.065X1X3+0.11X2X3－2.04X12－1.94X22－1.28X32。

表2 響應(yīng)面分析方案及實驗結(jié)果Table 2 Experiment project and outcome for response surface quadratic model

表3 回歸方程系數(shù)及顯著性實驗Table3 Analysisofvariance forresponse surface quadratic model

表3的回歸方差分析顯著性檢驗表明，該回歸模型顯著，失擬項不顯著，并且該模型的R2=0.970 8，Adj R2=0.933 3，說明該模型與實際試驗擬合較好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可以用于胡蘿卜中β-胡蘿卜素提取的理論預(yù)測。

2.7.2 響應(yīng)面分析 固定回歸方程的不同因素，做出相應(yīng)的曲面圖，由圖8～10可以看出，果膠酶含量（A）對β-胡蘿卜素的影響最顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，而超聲波時間和水解pH次之，表現(xiàn)為曲線較平緩，隨其數(shù)值的增加或減少，響應(yīng)面數(shù)值變化較小。果膠酶用量和超聲波時間的增加能提高β-胡蘿卜素提取率，并且其影響在一定值后達到飽和，而隨著pH值的增加，β-胡蘿卜素的提取率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，這是因為酶水解需要最適的酸堿環(huán)境。

由響應(yīng)面分析的結(jié)果可知，該模型的最大值點為:果膠酶用量為0.49 g，酶解pH 6.08，超聲波時間為 41.58 min，β-胡蘿卜素的最大提取率為 12.23 μg/g。

圖8 A-B相互影響的響應(yīng)面Fig.8 Response surface of A-B

圖9 A-C相互影響的響應(yīng)面Fig.9 Response surface of A-C

圖10 B-C相互影響的響應(yīng)面Fig.10 Response surface of B-C

2.7.3 響應(yīng)面分析驗證實驗 按照響應(yīng)面分析得出的較優(yōu)提取條件，做了四組平行驗證實驗。結(jié)果表明，在穩(wěn)定點上四組實驗得到的β-胡蘿卜素提取率分別是 12.01、11.89、11.97、11.63 μg/g，平均值為11.87 μg/g，與模型的理論值相差2.94%，可見該模型能較好地反映胡蘿卜中β-胡蘿卜素提取的條件。

3 結(jié)語

利用酶解水提法從胡蘿卜中提取水溶性β-胡蘿卜素的較優(yōu)工藝條件為:果膠酶量0.4 g，纖維素酶量1.5 g，酶解時間2 h，超聲波時間40 min，酶解pH 6，酶解溫度40℃。利用Design Expert 7.0軟件，采用Box-Behnken建立酶法水解從胡蘿卜中提取β-胡蘿卜素的回歸模型，方程擬合良好。在酶法水解從胡蘿卜中提取類胡蘿卜素的過程中，果膠酶量是影響類胡蘿卜素提取率的最關(guān)鍵因素，各提取因素對類胡蘿卜素提取率的影響順序為果膠酶量＞超聲波時間＞酶解pH。較優(yōu)提取工藝為:果膠酶量0.49 g，酶解 pH 6.08，超聲波時間 41.58 min，在此條件下預(yù)期的類胡蘿卜素得率是12.23 μg/g。以酶解水提的方法從胡蘿卜中提取的是水溶性的β-胡蘿卜素-蛋白質(zhì)復(fù)合物，與其在細胞內(nèi)的存在狀態(tài)一致，因此下一步的研究可以比較其和油溶性β-胡蘿卜素對光、熱、金屬離子、pH變化等的穩(wěn)定性差別，并且研究該復(fù)合物的生化性質(zhì)，如相對分子質(zhì)量、等電點、β-胡蘿卜素和蛋白質(zhì)的摩爾比、蛋白質(zhì)部分的分子結(jié)構(gòu)等等。

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