黃曲霉菌感染花生的不同檢測方法的應(yīng)用

張慧麗 ， 楊 松 ， 蘇君偉 ， 于洪波 ，徐文杰， 張麗男， 姜忠良， 孟憲軍*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學 食品學院，遼寧 沈陽 110161；2.遼寧大學 輕型產(chǎn)業(yè)學院，遼寧 沈陽 110036；3.沈陽軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗所，遼寧 沈陽 110026；4.遼寧省風沙地改良利用研究所，遼寧 阜新 123000）

花生是我國重要的油脂和食品原料，是我國具有國際市場競爭力的出口創(chuàng)匯經(jīng)濟作物，產(chǎn)量居世界前三位。但是由于近年來黃曲霉菌在收獲前期和保藏期的嚴重污染，合成的代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素危害更是巨大，使我國的產(chǎn)量和交易優(yōu)勢已不再明顯[1]。 寄生曲霉產(chǎn)四種主要黃曲霉毒素:B1，B2，G1，G2，而黃曲霉僅產(chǎn)B1和B2[2]。

黃曲霉毒素的污染分布于農(nóng)作物生長、收獲、儲運及產(chǎn)品加工等各個階段[3]，從農(nóng)田到餐桌，從糧油、牛奶、調(diào)味品到飼料，覆蓋廣，嚴重危害人、畜、禽類的健康[4-8]，黃曲霉毒素是迄今已發(fā)現(xiàn)的各種真菌毒素中最穩(wěn)定的一種，烹調(diào)加工溫度100℃以上也不能將其破壞[9]，毒性是砒霜的68倍，敵敵畏的100倍，比劇毒的氰化鉀毒性還大10倍之多[10-11]。對人及動物肝臟組織有破壞作用，低劑量長期攝入或一次大劑量攝入可引起肝臟的慢性或急性損害，嚴重時，可導(dǎo)致肝癌甚至死亡[12]，同時帶來巨大的經(jīng)濟損失。據(jù)FAO報道，全球每年約有40%的食品原料受真菌毒素的感染，黃曲霉毒素就是其中之一，約有2%的農(nóng)作物因污染嚴重而失去營養(yǎng)和經(jīng)濟價值[13]。

世界上針對花生抗黃曲霉菌污染展開了大量的研究，但是減少和消除黃曲霉毒素污染和危害的最有效的途徑還是選育和推廣抗黃曲霉花生品種[14]。自1967年Rao和Kulkarni發(fā)現(xiàn)不同品種花生對黃曲霉毒素污染具有不同程度的抗性以來，雖然迄今尚未發(fā)現(xiàn)高抗或免疫的抗性品種，但國內(nèi)外已開展了大量對黃曲霉抗性篩選的研究[15-16]。篩選的重要方法之一是應(yīng)用檢測黃曲霉菌生長程度或黃曲霉毒素合成量的多少。目前，黃曲霉毒素的常規(guī)檢測方法有薄層色譜法 （TLC）和高效液相色譜色譜法[17]，TLC一直是檢測部門普遍使用的方法，由于HPLC測定法具有高效、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好、準確可靠等優(yōu)點而得到越來越廣泛的應(yīng)用的，也是國際AOCO通用檢測方法[18]。其他的聯(lián)用技術(shù)也有研究報道，2010年鄭榮等用免疫親和柱凈化，用高效液相色譜-柱后衍生-熒光檢測器對黃曲霉毒素含量進行分析測定[19]。2012年栗建明等用快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定食品中黃曲霉毒素含量[20]。為了能更好評估花生對黃曲霉菌的易感程度以及黃曲霉菌的生長率和毒素合成量的關(guān)系，作者聯(lián)合黃曲霉毒素初定量的目測黃曲霉生長的表觀評估法、半定量的TLC和精確定量的HPLC三種方法對花生進行綜合評價，并篩選抗性品種[21-22]。不僅為黃曲霉毒素的污染檢測方法提供理論依據(jù)，而且對該領(lǐng)域的分子生物學的進一步實驗研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃曲霉A.flavus NRRL 3357:美國農(nóng)業(yè)部南方研究中心；18份花生參試品:遼寧省風沙所提供16份品種，葫蘆島正業(yè)花生有限公司提供2份品種；甲醇和冰乙酸:色譜級，費舍爾公司；黃曲霉毒素標準品:西格瑪公司；其他試劑:分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PC-9301CS薄層掃描儀:日本島津公司；硅膠G板:20 cm×20 cm，武漢藥科新技術(shù)開發(fā)有限公司；高效液相色譜儀:紫外2487，泵1525，沃特斯公司；474熒光掃描檢測器:沃特斯公司；HypersilODS反相色譜柱。

1.3 方法

1.3.1 黃曲霉侵染花生實驗 接種A.flavus NRRL 3357到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上，在28℃下倒置培養(yǎng)5 d，用0.05%曲拉通X-100水溶液制成濃度約為4×106個/mL孢子懸液后備用[23]。選取手工去殼、種皮飽滿和大小均勻無損傷的花生品種15粒。用0.1%氯化汞水溶液消毒后接種4×106個/mL孢子懸液2 mL，置于28℃恒溫生化培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)，7天后統(tǒng)計感染指數(shù)[14]。每個品種重復(fù)3次，平行實驗3次。

1.3.2 采用傳統(tǒng)分級標準評估黃曲霉感染實驗黃曲霉菌侵染花生后，根據(jù)傳統(tǒng)的分級標準，評估籽粒染菌程度，對黃曲霉毒素的含量進行初定量。分級標準如下[24]:

0級[0.0]:種仁正常；Ⅰ級[0.1]:種仁長出少數(shù)霉狀物，占種衣面積1/10左右；Ⅱ級[0.2]:種仁長出霉狀物，占種衣面積1/5左右；Ⅲ級[0.5]:種仁長出較多霉狀物，占種衣面積1/2左右；Ⅳ級[0.8]:種仁多數(shù)長出霉狀物，占種衣面積4/5左右；Ⅴ級[1.0]:種仁表面布滿霉狀物。

感染指數(shù)=（0.1n1+0.2n2+0.5n3+0.8n4+1.0n5）/N×100

式中，n為各級種仁染菌數(shù)值；N為供試總粒數(shù)。

根據(jù)黃曲霉對花生籽粒的感染指數(shù)劃分，R（抗）: 感染指數(shù)＜5.0；MR （中抗）: 感染指數(shù)5.1～10.0；MS（中感）:感染指數(shù) 10.1～30.0；S（感）:感染指數(shù) 30.1～50.0；HS（高感）:感染指數(shù)＞50.1。

1.3.3 黃曲霉毒素的提取 根據(jù)由AOAC標準測定方法[18]?；ㄉ鷺悠?0 g與200 mL的甲醇-水（85∶15）混合，搖勻。將混合物過濾，收集濾液并用25 mL的正己烷進行脫脂肪，再將其放入25 mL的氯仿中。將氯仿蒸干，然后將殘渣轉(zhuǎn)移到帶有氯仿的玻璃瓶中。然后在40℃溫和的氮中將氯仿蒸發(fā)掉。殘渣在250 mL的氯仿中再溶解并且存在-20℃條件下，直到被分析。

1.3.4 薄層層析法（TLC）檢測黃曲霉毒 分別吸取18種參試樣品毒素提取液和20 ng/mL的黃曲霉毒素標準品，在硅膠板上距底端2 cm處按標記點樣10 μL，放入加蓋平衡半小時后的丙酮-三氯甲烷展開劑中。將薄層板點樣一端浸入展開劑中密閉展開。當展開層劑前沿達到薄層板的2/3高度時，取出層板。放入通風櫥中晾干。在365 nm紫外燈下觀察照相熒光斑點。將展開后的層析板放到薄層掃描儀中370 nm處掃描，根據(jù)掃描得出的峰面積對樣品感染的黃曲霉毒素含量進行半定量測定。

1.3.5 高效液相法測定黃曲霉質(zhì)量濃度 根據(jù)前期的結(jié)果，將毒素質(zhì)量濃度最多的和最少的樣品進行HPLC，測定黃曲霉質(zhì)量濃度。標準品黃曲霉B1質(zhì)量濃度為50 ng/mL，色譜條件:色譜柱Hypersil ODS，3 mm×100 mm×4.6 mm；流動相:甲醇-水-冰乙酸（45∶55∶2）；流速 1.5 mL/min；進樣量:10 μL；熒光檢測器激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm；運行時間22 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生感染黃曲霉的表觀特征

花生籽仁接種黃曲霉菌1 d后，可見籽仁飽滿，有發(fā)芽的跡象，2 d后可見籽仁表面有少量的灰白菌絲體，5～7 d 后可見綠色孢子簇產(chǎn)生，7～10 d，孢子堆滿種仁表面的某一部位，菌絲逐漸蔓延甚至包裹整個花生，孢子簇向整粒種子擴散?；ㄉ适?，略有干癟。

2.2 采用傳統(tǒng)分級標準評估黃曲霉毒素實驗

通過接種黃曲霉菌來感染花生，未發(fā)現(xiàn)對黃曲霉菌感染有免疫能力的種質(zhì)。黃曲霉菌能侵染所有被鑒定的18份花生并生長，但生長勢和感染指數(shù)在不同品種之間差異很大。18份花生品種平均結(jié)果見圖1。高抗品種2份，分別是:白沙1016和阜花11號，感染指數(shù)＜5，明顯高于其他花生品種的抗性。中抗品種2份，分別是遠雜9102和304，感染指數(shù)在5.1～10.0。中感品種12份，分別為螺4087、2009-6、阜花 1.2、花育 20、魯花 12 號、徐 9703、萊農(nóng) 26、阜花 14、R-08-3、阜花 12、珍珠紅、9820-1，感染指數(shù)在10.1～30.0。高感品種2份，分別為紅崖子小白沙和紅崖子四粒紅，感染指數(shù)＞30.1。

圖1 不同品種感染黃曲霉差異比較Fig.1 Difference peanut lines infected by Aspergillus flavus

2.3 薄層層析法（TLC）檢測黃曲霉毒素

花生感染黃曲霉菌后在適宜的條件下產(chǎn)生毒素，對感染后的花生進行黃曲霉毒素提取，經(jīng)過點樣、層析、掃描后，通過對比各品種的峰面積，得出18種花生的黃曲霉毒素質(zhì)量濃度，見表1、圖2和圖3。

圖2 黃曲霉毒素熒光薄層色譜（FLU-TLC）Fig.2 FLU-TLC of Aflatoxin

圖3 熒光薄層的峰面積Fig.3 Peak area of FLU-TLC

由掃描結(jié)果可知，紅崖子小白沙的峰面積最大，黃曲霉侵染后的產(chǎn)生的毒素最多，質(zhì)量濃度為30.92 ng/mL，紅崖子四粒紅的峰面積與紅崖子小白沙相近，而阜花11的最小質(zhì)量濃度為2.72 ng/mL，產(chǎn)生的黃曲霉毒素最少。

綜合感染實驗和黃曲霉毒素含量檢測的實驗結(jié)果，可知花生品種分為抗黃曲霉菌感染和抗產(chǎn)毒素兩個方面，本實驗選用的品種侵染率和合成毒素質(zhì)量濃度基本一致。通過對18份花生的篩選鑒定發(fā)現(xiàn)，感染率高的品種，產(chǎn)毒量一般都較高，例如紅崖子小白沙、紅崖子四粒紅、螺4087等，而感染率低的品種，產(chǎn)毒量可能較高或較低，例如遠雜9102的感染率低于R-08-3、阜花12、珍珠紅等，但其產(chǎn)毒量卻明顯比它們高；而白沙1016和阜花11的感染率是最低的，它們的產(chǎn)毒量也最低。

2.4 高效液相色譜法（HPLC）檢測黃曲霉毒素

對感染后的花生進行黃曲霉毒素提取，并用高效液相色譜法測定紅崖子四粒紅和阜花11黃曲霉毒素提取樣品，將峰面積與標準品進行比較，得出紅崖子四粒紅中黃曲霉毒素質(zhì)量濃度為30.21 ng/mL，阜花11中黃曲霉毒素質(zhì)量濃度為2.55 ng/mL，見圖4。

表1 花生品種感染指數(shù)和FLU-TLC結(jié)果Tab.1 Infection Index and FLU-TLC valueof Aflatoxinon peanut lines

圖4 高效液相色譜測定黃曲霉質(zhì)量濃度結(jié)果Fig.4 HPLC Value of Aflatoxin on peanut lines

3 結(jié)語

花生黃曲霉感染是一種普遍但危害巨大的病害，雖然其發(fā)病程度受環(huán)境和實驗條件的影響很大，目前還難以制定統(tǒng)一的抗性分級標準，但本方法是在基于表觀評估、TLC半定量法和HPLC準確定量的方法的基礎(chǔ)上建立起來的。通過實驗表明，選取的花生品種這三種方法基本一致，特別是易感和抗性品種中具有高度的一致性。抗產(chǎn)毒的能力鑒定，主要依賴于對感染了黃曲霉菌的花生進行黃曲霉毒素檢測，測得的質(zhì)量濃度越低，表明該品種抑制黃曲霉菌產(chǎn)毒的能力越強；反之，則表明該品種的抗產(chǎn)毒性越弱[25]。

作者采用黃曲霉NRRL3357菌株是具有代表性的黃曲霉測序的菌株，鑒定出的高抗品種，對黃曲霉具有普遍抗性，可以作為花生品種抗黃曲霉的初篩依據(jù)[26]。經(jīng)接種后的花生仁上霉菌孢子較多，故未對樣品進行磨碎處理，只直接提取了整粒樣品的部分毒素，花生內(nèi)部的毒素沒有計算在內(nèi)。

本研究鑒定篩選出2個高抗黃曲霉毒素的花生品種，分別是白沙1016和阜花11。實驗結(jié)果表明，這兩種花生既是抗感染又是抗產(chǎn)毒的品種，可作為在種植和保藏期期間抵抗黃曲霉菌的優(yōu)良品種來源，具有一定意義上的推廣價值，這不僅有利于提高花生的質(zhì)量，減少黃曲霉毒素的產(chǎn)生和沿食品飼料鏈傳遞，還真正保障了食品安全和人民健康。

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