納豆芽孢桿菌發酵生產MK-7的產物提取與檢測

嚴為留， 張偉國*， 錢 和， 魯 洋

（江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

納豆作為日本傳統食品，和中國豆豉一樣，食用已有上千年的歷史，現在每年產量超過30萬t[1]。1996年，Sato T[2]等人從發酵納豆中提取純化到MK-7。隨后，國內外研究人員對傳統發酵食品中的MK-7進行了大量的研究，結果表明，納豆中MK-7的含量較其他的食品要高很多 （約900 μg/100g納豆），是世界上富含MK-7最多的食品。除了日本納豆以外，東南亞各國的印尼豆豉和中國豆豉中MK-7的含量也比較豐富[3-4]。

MK-7，又稱甲萘醌-7，是由一個甲基萘醌母環和七個異戊二烯側鏈連接而成，是維生素K2 14種同系物家族中的一員。和其他維生素K2同系物一樣，MK-7是哺乳動物產生凝血因子II、VII、IX以及X的一個非常重要的輔因子，是正常血液凝固時不可或缺的營養素[2，5]。MK-7還能夠活化鈣化抑制基質 Gla 蛋白質（matrix Gla protein MGP），從而防止鈣質在血管中沉淀而造成的動脈硬化[6-7]。另外，MK-7能夠將骨髓中的骨鈣素活化，從而促進骨頭的形成[8-9]。最近的流行病學研究表明，納豆中的MK-7能夠顯著提高老年人骨頭中的礦物質密度（BMD），降低老年人的髖骨骨折風險[4，10-11]。

作者從商品納豆和商品豆豉中分離到一株產MK-7的解淀粉芽孢桿菌Y-2，利用豆漿培養基進行液態發酵，原料和工序都與固態發酵生產納豆和豆豉類似，避免了因菌種和培養基成分不明而引起的毒性問題，所得到的產品理論上安全無毒，經過初步濃縮即可作為食品添加劑食用，因此具有較大的應用潛力。但是存在一個明顯的問題就是豆漿培養基成分復雜，尤其是其中存在的大量油脂會干擾同樣是脂溶性的MK-7的檢測。因此如何從一種類似膠體的發酵液中提取、檢測微量的MK-7成為首先要考慮的問題。作者摸索了一條萃取濃縮的提取方法，經高效液相色譜檢測，能夠較好地反映出MK-7的質量濃度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌體 納豆芽孢桿菌Y-2:由作者所在實驗室篩選并保藏。

1.1.2 主要試劑 MK-7標準品 （純度99.8%）:購自美國ChromaDex公司；甲醇、乙腈和二氯甲烷:色譜純；正己烷、異丙醇等其他試劑:分析純；豆粉:由市售大豆粉碎而成，顆粒度≤40目。

1.1.3 主要儀器 DIONEX高效液相色譜儀（DIONEX P-680 泵 、ASI-100 自 動 進 樣 器 、TCC-100柱溫箱）:美國DIONEX公司；Thermo ST16高速離心機:美國Thermo公司；TECHNE TC-5000 PCR儀:美國TECHNE公司；PHS-2C精密酸度計:上海天達儀器有限公司；UNICO UV-2100紫外-可見光分光光度計:美國UNICO公司；HYL-B全溫搖瓶柜:太倉市強樂實驗設備廠。

1.2 方法

1.2.1 培養基

1） 平板培養基（g/L）:大豆蛋白胨 10，牛肉膏3，NaCl 5，瓊脂條 20。

2） 種子培養基（g/L）:大豆蛋白胨 10，牛肉膏3，NaCl 5。250 mL三角瓶裝液量為50 mL。

3） 發酵培養基（g/L）:豆粉 100，大豆蛋白胨 5，酵 母 膏 1.5，KH2PO41，K2HPO4·3H2O 2.5，NaCl 1，MgSO4·7H2O 0.5。豆粉先用適量水煮沸成豆漿，冷卻備用。500 mL三角瓶裝液量為100 mL。

三種培養基均以200 g/L的NaOH溶液調pH值至7.0～7.2。平板和種子培養基在0.1 MPa滅菌20 min，發酵培養基在0.07 MPa滅菌10 min[12]。

當前，我國各地基層派出所處理的相當一部分警情都是非警務糾紛，有的地方非警務糾紛甚至占到受案總量的60%以上。人民調解員的入駐，警調聯動機制的建立，有助于緩解這一問題，使得基層民警把更多精力用于處理警情警務，更好地履行維護社會治安的職能。

1.2.2 培養方法

1） 平板培養方法:（37±1） ℃恒溫培養 24 h。

2）種子培養方法:（37±1）℃往復式搖床培養10 h，振蕩 120±2 次/min，振幅 8 cm。

3）發酵培養方法:接種體積分數2%，（37±1）℃往復式搖床培養24h，振蕩120±2次/min，振幅8cm。

1.2.3 溶液的配制

1） 萃取液:正己烷∶異丙醇=2∶1，混勻后備用。

2）標準品溶液:準確稱取1 mg的MK-7標樣，加入按乙腈∶二氯甲烷∶甲醇=3∶1∶1的比例配制好的混合溶劑1 mL，充分溶解后用0.22 μm微孔濾膜過濾，密封避光保存。

1.2.4 樣品的處理 參照國外研究人員[13-14]的處理方法，并加以改進。發酵結束后，按4∶1的體積比加入萃取液，即4體積的發酵液加入1體積的萃取液，振搖1 min，5 000 g離心5 min后取上清液，減壓旋轉濃縮，得到淡黃色油狀物。加入4 mL正己烷溶解，轉移到10 mL離心管中，并用1.5 mL異丙醇潤洗后合并加入，再加入1 mL水，旋渦混勻10 s，5 000 g離心5 min。取上層有機相，通N2吹干，加入1 mL 混合溶劑 （乙腈∶二氯甲烷∶甲醇=3∶1∶1） 溶解，0.22 μm微孔濾膜過濾后得到最終的樣品，上機分析。

1.2.5 液相色譜條件

色譜柱:Waters AccQ·Tag （3.9 mm×150 mm）；流動相:甲醇；流速:1.0 mL/min；柱溫:32℃；進樣量:10 μL；紫外檢測波長:270 nm。

2 結果與分析

2.1 菌種鑒定

提取實驗菌株Y-2的基因組，并以此基因組為模板，擴增其16S DNA，送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序，將得到的序列在NCBI上進行BLAST比對，得到一個登錄號為lcl:36083。結果表明，Y-2與芽孢桿菌屬同源性達到99%，初步認定屬于芽孢桿菌屬的一種。

2.2 系統發育樹的繪制

為進一步考察實驗菌株與已知菌株的親緣關系及其分類地位，將實驗菌株的16S DNA序列與同源菌株進行比較，用MEGA 4.0軟件中的Neighborjoining分析法構建系統進化樹，結果見圖1。結果表明，沒有一株菌與Y-2的親緣關系最近，需要進一步進行生理生化鑒定來判斷Y-2屬于哪個種。

圖1 Y-2基于16S DNA構建的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree inferred from 16S DNA of Y-2

2.3 MK-7檢測波長的確定

根據MK-7標準品的紫外吸收光譜，MK-7在190～400 nm的波長范圍都有不同程度的吸收強度。其中在210 nm附近吸收強度最大，在246 nm和270 nm附近也有較強吸收。文獻中對MK-7的檢測波長也大都設置在這三種波長附近[14-15]。我們首先在210 nm波長下檢測MK-7的質量濃度，結果見圖2。可以看出，樣品峰拖尾現象比較嚴重，特別是樣品中可以檢測出的雜峰比較多，嚴重干擾MK-7的檢測，檢測結果的準確度不高。為了解決這個問題，作者隨后比較了樣品在246 nm和270 nm兩個波長下的吸收情況，結果發現，在246 nm（圖3）時，樣品中可以檢測出的雜峰明顯減少，但是峰形拖尾，峰與峰之間分離效果不好。而在270 nm（圖4）波長下，樣品中可以檢測出的雜峰進一步減少，峰與峰之間分離度較高，而且峰形拖尾現象有了比較好地改善。隨后向樣品中加入MK-7標準品作為內標進行驗證，并進行LC-MS檢測，結果進一步驗證了樣品中所分離到的色譜峰即MK-7。因此，在接下來的實驗中選擇270 nm作為MK-7的檢測波長。

2.4 流速和柱溫的確定

在確定了檢測波長之后，作者隨后考察了流速和柱溫對樣品分離效果的影響。首先在30℃柱溫下，研究了樣品在 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL/min 五個不同流速下的出峰效果。由結果可知，隨著流速的提高，MK-7的出峰時間也逐漸提前。當流速小于1.0 mL/min時，峰形拖尾較為嚴重；超過1.0 mL/min后，峰形并無多大變化。綜合考慮，選擇1.0 mL/min作為檢測流速。然后在1.0 mL/min的流速下，分別研究了 28、30、32、34、36 ℃五個溫度對 MK-7 出峰效果的影響。結果表明，溫度對MK-7出峰效果的影響沒有流速大，樣品在幾個溫度下的出峰效果都比較理想。但是在同樣的峰面積下，32℃條件下出的峰高度要較其他溫度下的峰高要更高一點，即峰形要更好一點。由此可以判斷，32℃是MK-7的最佳出峰溫度。

2.5 標準曲線及檢出限

在得到MK-7的最佳色譜檢測條件后，以進樣體積為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制MK-7的標準曲線，得到線性回歸方程為y=39.035x-21.117，線性相關系數R2=0.999 9，線性范圍為70～500 μg/mL，檢出限為 1 μg。

圖2 樣品在210 nm波長下的色譜圖Fig.2 Chromatogram of sample detected in 210 nm

圖3 樣品在246 nm波長下的色譜圖Fig.3 Chromatogram of sample detected in 246 nm

圖4 樣品在270 nm波長下的色譜圖Fig.4 Chromatogram of sample detected in 270 nm

2.6 回收率實驗

取MK-7的發酵液3份，分別加入一定量的MK-7標準溶液，按1.2.4的方法處理后檢測，平行測定3次。由結果可知，MK-7的加標回收率為95%～101%，表明該方法的準確性較好。

2.7 發酵液中MK-7的分析

在1.2.5所述的色譜條件下對不同發酵周期的發酵液中MK-7的質量濃度進行檢測，結果見圖5。可以看出，在未優化的情況下，24 h后MK-7的搖瓶產量達到 1178 μg/L。

圖5 MK-7在不同發酵周期中的產量Fig.5 Production of MK-7 in different fermentation periods

3 結語

煮熟的大豆作為納豆和豆豉芽孢桿菌的傳統培養基已有悠久的歷史，菌體經過進化，其代謝途徑中的各種酶已經能充分利用大豆中的各種營養素來維持自身的生長并產生大量的MK-7，而且所得到的產品的安全性也毋庸置疑。這一點是我們選擇豆漿作為培養基的一個重要原因，因為豆漿也是由大豆加工而成的，豆漿里面的營養素組成在理論上應該和大豆相近而且利用率應該更高，作者的研究結果也證實了這一點，同時建立了一種較為準確可靠的MK-7提取與檢測方法，為今后利用豆漿培養基進行大規模發酵掃清了障礙。

為了提高MK-7的產量，同時節約發酵后MK-7的提取和純化成本，國外研究人員大多利用甘油作為碳源、大豆蛋白胨作為氮源，以較澄清的發酵液進行發酵[15-18]。但是本研究旨在獲得一種將發酵液簡單處理過后即可作為食品添加劑使用的MK-7粗制品，并且這種粗制品在理論上具有較高的安全性。從目前的情況來看，MK-7的產量還不夠高，今后研究的重點應該在如何優化發酵條件來進一步提高MK-7的產量上。

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