骨髓間充質干細胞在骨缺損修復中的研究及應用進展＊

張 聰 綜述 孟純陽 審校

（濟寧醫學院附屬醫院，山東 濟寧272067）

骨缺損是臨床常見的疾病，是由創傷、腫瘤切除、畸形矯正以及感染等各種因素造成的。由于骨缺損造成骨結構的改變，往往使骨的愈合成為奢望，即使能夠愈合，也常需要一年或更長時間［1］，同時需要相關固定和制動，且制動臥床易導致多種并發癥，如褥瘡、呼吸系統感染、泌尿系統感染、患肢廢用性萎縮等，給家庭和社會造成嚴重的負擔，也嚴重影響了患者的勞動能力和生存質量。骨髓間充質干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BM－MSCs）由Friedensten等［2］最先發現，其具有成骨分化潛能，取材方便、體外生長迅速，在體外一定條件誘導下能夠定向分化為成骨細胞，并且有較強的傳代能力，回輸體內后高效穩定增值等優點，成為修復骨缺損的良好種子細胞。對于嚴重或大塊骨缺損，即使我們采用自體骨、異體骨或組織工程骨植入，除植骨周圍有少量細胞存活外，大部分骨缺損內缺乏足夠的BM－MSCs，延遲了愈合時間。因此，向骨缺損部位引入足夠的BM－MSCs是促進骨缺損修復的重要細胞學基礎和前提條件［3］。BM－MSCs作為骨缺損修復的種子細胞已越來越受到關注，已經成為21世紀再生醫學研究的主要熱點之一。筆者就BM－MSCs在骨缺損修復中的研究進展綜述如下。

1 骨髓間充質干細胞的生物學特性

BM－MSCs來源于骨髓間質，約占骨髓內單個核細胞數的1／104～1／55，并隨年齡的增加而減少，但是其擴增能力很強，在指數增長期時間約需要30h左右，且其體外傳40代仍然具有干細胞特性。BM－MSCs就有跨系譜、跨胚層分化的潛能［4］，向內中外三胚層分化，不僅可以分化為造血基質細胞，還可以分化為許多造血以外的組織細胞，如內皮細胞、肝細胞、肺上皮細胞、成骨細胞、軟骨細胞、肌腱細胞、脂肪細胞、心肌細胞等中胚層細胞，同時又有外胚層的神經元細胞和內胚層的肝卵圓細胞分化的能力。

BM－MSCs最初的分離培養方法系Friedensten在1987年建立的貼壁分離篩選法，目前用于BM－MSCs純化分離的方法主要包括4種：1）貼壁分離篩選法：也稱全骨髓培養法，是根據BMMSCs貼壁生長而造血系細胞懸浮生長的特性，通過定期換液以除去非貼壁細胞。此法雖被認為粗糙，但操作簡單方便，分離純度較高。2）密度梯度離心法：原理是根據估算中細胞成分比重不同及BM－MSCs的細胞密度大小，進行密度梯度離，得到單個核細胞，再配合上述1）方式進一步分離純化，其純度可達95%。3）流式細胞儀篩選法：主要是根據細胞大小來實現分離，利用一種有微小孔徑的的培養皿從骨髓中篩選BM－MSCs這種方法分離出BM－MSCs均質性高，但細胞成骨活性低，培養發現大多數不貼壁，并在24h內死亡，可能是分選過程中機械剪切力造成了BM－MSCs損傷。4）免疫磁珠分離法：其原理是通過BM－MSCs表面帶有抗原成分或缺失抗原成分進行篩選，從而得到相對純化的BM－MSCs，但是其無特有標記分子，所以該方法在實際應用中有一定的局限性［5］。

目前研究表明BM－MSCs并無獨特的表面標志，實際應用中，采用表面標志和細胞形態學兩方面對BM－MSCs進行鑒定是比較公認的方法。2006年國際間充質及組織干細胞委員會（the Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular Therapy）對hBM－MSCs（Human mesenchymal stem cells，hMSC）提出3條最低的鑒定標準1）在標準培養條件下必須具備有對塑料瓶底物的貼壁特性。2）通過流式細胞儀檢測BM－MSCs群體表達CD73、CD90、CD105的陽性率大于95%，且CD34、CD45、CD14或CD11b、CD79a或CD19HLA－DR陽性率表達低于2%。3）經體外誘導必須能向成骨細胞、脂肪細胞及軟骨細胞分化。

2 骨髓間充質干細胞向成骨分化生長的影響因素

BM－MSCs具有多向分化的潛能特性，而用于治療骨缺損中需要向成骨細胞分化。BM－MSCs體外誘導分化成骨主要經歷了以下幾個階段：轉化期、增殖期、聚集分泌期、細胞外基質鈣化期，在整個誘導分化過程中可以看到成骨因子含量增高，Ⅰ型膠原合成增多，鈣結節數量增多，逐漸變成具有成骨細胞生物活性的細胞。體外誘導BM－MSCs向成骨細胞分化可以使用誘導培養基［6］，較為經典的是使用地塞米松、維生素C、β－磷酸甘油，地塞米松可以促進成骨細胞分化成熟，同時提高堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）的活性，調節成骨細胞分泌胰島素樣生長因子（insulin－like growth factor，IGF），促進細胞外膠原基質合成；維生素C的作用是促進培養細胞合成膠原，調節三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、ALP活性和非膠原基質蛋白的合成；β－磷酸甘油為成骨細胞提供磷酸離子，促進生理性鈣鹽沉積、鈣化，從而加速鈣結節鈣化過程。

另外骨形態發生蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、IGF、1，25－（OH）2D3、透明質酸均可促進MSCs向骨組織分化［7］。

3 骨髓間充質干細胞修復骨缺損的相關研究進展

BM－MSCs具有多向分化潛能，在體外特定實驗條件下或自身骨愈合修復的微環境下可以向成骨細胞分化，具有良好的增殖和自身移植能力，其取材不存在倫理方面的爭議［8］，因此受到廣大組織工程學學者的青睞。現根據其在骨缺損修復中應用方法不同分以下幾類：

3.1 BM－MSCs單獨應用治療骨缺損

吳志玲等［9］抽取兔骨髓制成細胞懸液，體外分離培養BM－MSCs 2周。將培養2周的BM－MSCs注射到家兔單側橈骨缺損處，對側不予處理，于移植后第1、2、3、4周末，用鉬靶X線分別檢查雙側橈骨缺損處的骨形成情況，并取第4周末的骨痂進行組織學檢查，結果顯示移植后實驗側骨痂形成快于對照側；第4周末，實驗側缺損處全部為骨性骨痂連接，對照側缺損處仍未形成骨痂連接，說明BM－MSCs注射可以促進骨缺損修復。Mcnulty等［10］認為骨缺損區足夠量的MSCs是骨修復的必要條件，其預先使用MSCs動員劑AMD3100，促使MSCs向外周血中聚集，在骨缺損處MSCs濃度可增加40倍，組織學和X射線檢查顯示骨修復效果優于空白對照組。

3.2 非基因轉染BM－MSCs作為種子細胞應用治療骨缺損

用BM－MSCs構建組織工程骨有必不可少的3要素：具有向成骨方向誘導能力的間充質干細胞、支架材料、誘導和調節成骨細胞分化的生長因子。Breitbart等［11］采用異體脫鈣骨（demineralized bone matrix DBM）體外與BM－MSCs復合培養后，植入股骨骨缺損的糖尿病小白鼠模型中，BM－MSCs／DBM組與DBM組在第4周、8周的組織學觀察了解到，BM－MSCs／DBM組有大量成骨細胞和骨基質形成。該實驗顯示出BM－MSCs作為種子細胞在可能會在糖尿病病人的骨缺損治療中具有廣闊的應用前景。NiemeyerP等［12］認為人源干細胞具有低免疫源性、良好成骨細胞分化性，因此異種接種于骨材料上對大段骨缺損有良好修復作用，試驗中采用脫鈣羥基磷灰石（calciumdeficient hydroxyapatite，CDHA）為支架材料，hMSC／CDHA、兔MSC／CDHA、CDHA分別植入家兔顱骨骨缺損處，組織學、影像學、生物力學檢測顯示出hMSC／CDHA組均差于其余兩組，說明了雖然異種MSC具有低免疫源性，但進行骨缺損治療中應選取自體或同種MSC更為合適。Zhang等［13］認為人富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）含 有 多 種 生 長 因 子，如PDGF、TGF－β1、TGF－β2、IGF、EGF，它們對血管形成和細胞增殖發揮重要作用，同時PRP能夠提高BM－MSCs的增殖活性，增加細胞外基質合成，增強成骨活性。以脫蛋白骨基質（deproteinized bone matrix，DPB）為支架材料，將MSC／DPB組與異體PRP／DPB組治療家兔骨缺損，并通過組織學分析、X線顯影、骨密度測量顯示出良好的骨形成和再血管化，效果優于單獨使用DPB的對照組；同時MSC／PRP／DPB組在骨缺損修復中的強效骨再生和再血管化又優于上述3組。異體PRP具有低免疫源性、易獲得性，不額外增加病人的健康風險，自體MSC與異體PRP在骨修復中的協同作用將會在大段骨缺損治療中顯示出巨大的發展空間和應用前景。Stockmannp等［14］分別分離出脂肪源性（adiposederived，AD）、骨膜源性（periosteum－derived，PD）、骨髓源性（bone marrow－derived，BD）間充質干細胞做體外培養，將上述3種不同來源的MSCs種植于膠原支架上，然后將組織工程材料植入豬新鮮顱骨骨缺損處，并以空白支架為對照組，在早期（30d以內）實驗組與對照組在骨再生方面無差異，中期及后期（30～90d）3個實驗組在骨質含量、骨愈合方面與對照組相比均有明顯優勢，且在整個試驗階 段3個實驗組的AD－MSC、PD－MSC、BDMSC作為種子細胞修復骨缺損方面無明顯差異。Osuqi M等［15］采用IGF1、VEGF細胞生長因子的條件培養基（Cultured conditioned media，CM）體外培養BM－MSCs，與其余4組無血清DMEM／瓊脂糖、無糖DMEM／瓊脂糖、PBS／瓊脂糖、空白組分別植入顱骨缺損小鼠模型中，術后8周，CT、組織學分析。CT顯示MSCs－CM組比其余4組有大量骨組織再生，建立良好的骨橋，組織學分析顯示骨缺損處有大量成骨細胞。在后期的生物力學檢測中MSCs／CM組的抗扭曲度、抗壓縮度均強于其余四組，說明在一定的培養條件下BM－MSCs的骨缺損修復能力會進一步增強。

3.3 帶有目的基因的BM－MSCs作為種子細胞應用治療骨缺損

Cao等［16］將轉血管生成素－1（Angiopoietin－1，Ang－1）基因BM－MSCs種植于多孔β－磷酸三鈣（tricalcium phosphate，β－TCP）支架修復新西蘭大白兔橈骨骨缺損處，術后2、4周分別使用電子顯微鏡、組織學切片觀察骨細胞再生和微血管生成情況，與MSCs／β－TCP對照組相比差異有統計學意義，術后12周生物力學測定顯示該組骨強度接近正常骨組織。由于使用了可有效持久釋放Ang－1，減弱了新生骨及新生血管在骨修復處處不能長入或長入緩慢的束縛，縮短了骨愈合時間。張波等［17］觀察重組BMP2和VEGF165轉染BMMSCs后的體外表達情況，并以含該轉染體系的組織工程骨進行山羊顱骨骨缺損的修復研究發現轉基因BM－MSCs在轉染后1～3周都可穩定表達BMP2和VEGF，BM－MSCs和－TCP支架材料植入顱骨標準骨缺損處術后12周，組織學觀察聯合基因（BMP2／VEGF165）組有明顯成骨表現，骨組織結構趨于正常，可見形成較多的類骨樣組織，中間為骨基質，表明攜帶該緩釋體系的新型組織工程骨是一種具有顯著成骨能力的優良骨缺損修復材料。LIN等［18］以BMP4基因轉染兔BM－MSCs，轉染后的BM－MSCs體外培養觀察ALP、骨鈣素（osteocalcin，OCN）的表達情況，然后將其植入兔顱骨缺損進行修復，結果提示BM－MSCs經過BMP4基因轉染后存在較強成骨能力，與BMP4基因轉染脂肪來源干細胞組相比，兩者在體外成骨方面無較大的差異，同時BM－MSCs沒有分化脂肪細胞的趨勢。Hex等［19］采用將納米硫酸鈣／海藻酸鈉（nano－scale calcium Sulfate／Alginate，nCS／A）制作成膏狀與轉染BMP2基因的MSCs混合直接注入骨缺損部位的新方法，保證了支架材料內部較高的MSCs數量和缺損修復區BMP2濃度，結果顯示，該方法與nCS／A組和nCS／A／MSCs組相比有更高的骨修復能力和微血管密度。

4 現存問題與展望

雖然人們對BM－MSCs的研究和BM－MSCs應用修復骨缺損的研究取得了顯著的成就，形成了自體骨移植、異體骨移植、組織工程骨移植修復骨缺損的3大領域，但是BM－MSCs作為種子細胞的應用仍有一些問題困擾、阻礙我們：1）分離純化細胞的方法需進一步改進，大多數實驗室仍是根據細胞貼壁的性質分離細胞，細胞純度和功能不能令人滿意；2）未能找到鑒定MSCs特異性的標記分子，鑒定標準不夠完善；3）BM－MSCs具有多向分化潛能，體外分化是否會引起細胞遺傳性質的改變還有待進一步證實；4）是否植入體外誘導具有成骨細胞特性后的BM－MSCs，還是完全依賴體內誘導環境直接植入BM－MSCs；5）部分研究采用不同類型的材料作為支架，但哪一種材料更有利于BM－MSCs生長分化且生物相容性好，降解速度適當，不良反應小，仍需探索，同時最好能夠研制出既有骨傳導作用又有骨誘導作用的材料［20］；6）找到支架材料的最佳孔隙率、孔徑大小和最佳BM－MSCs的植入濃度，是今后亟待解決的問題；7）臨床療效和安全性問題是BM－MSCs及轉入某些基因后臨床治療時需要明確的根本問題，體外長期培養的BMMSCs移植到體內后是否會發生基因突變或導致腫瘤等是臨床應用中最令人擔憂的問題，因此，必須建立可靠的技術方法和安全評估體系；8）雙基因或多基因共轉染BM－MSCs，其所表達產物間是否存在協同作用或拮抗作用有待進一步探明［21］；9）如何保持骨修復區MSCs足夠數量，是否有必要使用MSCs動員藥物［22］；10）雖然BM－MSCs修復骨缺損有部分臨床報道，但多數還是在基礎實驗階段，過渡于臨床還需大量臨床實驗驗證。

隨著科學技術的進步和大量實驗的不懈探索，重組BM－MSCs和支架材料已成為研究熱點，持續的誘導因子和生長因子分泌表達，模仿成骨微環境，良好骨傳導性和生物相容性支架材料等都是加快骨缺損修復的不可或缺條件，相信在不久的將來，BM－MSCs在臨床治療骨缺損中發揮更大的作用。

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