新型輔助性T細胞亞群Th9與相關疾病的研究進展

楊璟輝，宋少華，傅志仁

經典的免疫學理論認為，CD4+T細胞根據誘導分化條件﹑細胞因子分泌及免疫學功能的不同，可分為Th1﹑Th2﹑Th17及Treg細胞。Th1主要由IL-12誘導分化，主要分泌IL-2﹑干擾素(interferon，IFN)γ等，參與包括移植排斥反應﹑遲發型超敏性炎癥反應等在內的細胞免疫，清除胞內病原體；Th2主要由IL-4誘導分化，主要分泌IL-4﹑IL-5﹑IL-6﹑IL-10等，可輔助B細胞分化，刺激B細胞增殖并產生抗體，介導體液免疫，清除胞外病原體；Th17主要由TGF-β和IL-6誘導分化，主要分泌IL-17﹑IL-17F﹑IL-22﹑IL-21等，介導炎癥反應﹑自身免疫性疾病﹑移植排斥和腫瘤的發生發展；Treg主要由TGF-β誘導分化，主要分泌TGF-β﹑IL-10，介導免疫耐受及抑制抗腫瘤免疫[1-2]。隨著研究的深入，科學家們又發現了一群新的以分泌IL-9和IL-10為特征的CD4+T細胞亞群——Th9，本文對這一最近發現的T細胞亞群綜述如下。

1 Th9的發現

眾所周知，轉錄因子Foxp3對Treg的產生至關重要，而TGF-β能夠誘導初始T細胞表達Foxp3，并促進其向Treg分化[3]。2008年，Dardalhon等[4]研究發現IL-4能夠抑制TGF-β對Foxp3的誘導作用，且可與TGF-β協同作用誘導出能夠分泌IL-9和IL-10的細胞亞群。這群細胞雖然能夠產生大量IL-10，卻不具有免疫調節特性，相反能夠誘導免疫缺陷小鼠(RAG-1-/-)發生結腸炎及外周神經炎。同年，Veldhoen等[5]發現IL-4與TGF-β具有協同作用，能夠促進Th2再編程(reprogram)并分化為主要分泌IL-9的新細胞亞群。鑒于這群細胞主要分泌IL-9，在功能上又不同于經典的Th2細胞，研究者將其稱為Th9。既往研究表明，IL-9可由肥大細胞﹑天然淋巴細胞﹑自然殺傷性T細胞和調節性T細胞等多種細胞分泌，主要涉及Th2細胞參與的多種免疫應答，因此一直以來，人們普遍認為IL-9是Th2類細胞因子[5]。然而，Dardalhon等[4]與Veldhoen等[5]的研究結果表明，Th9細胞雖然分泌大量的IL-9，卻與Th2細胞功能迥異。進一步研究顯示，這群細胞并不表達已知的Th細胞亞群特異性的轉錄因子T-bet(Th1)﹑GATA-3(Th2)﹑Foxp3(Treg)以及RORγT(Th17)。因此，Th9區別于以往其他的Th細胞亞群，是一類新的Th細胞亞群。

2 Th9的誘導、分化及培養

自Th9被確認為一類新的Th細胞亞群之后，研究者對其誘導﹑分化及培養途徑進行了大量探索。目前，初步研究顯示，體外至少有2種途徑可以獲得Th9。

2.1 CD4+初始T細胞分化為Th9 正如Dardalhon等[4]的研究所示，人或鼠的CD4+初始T細胞在體外IL-4和TGF-β聯合刺激誘導條件下，細胞內IL-9mRNA表達升高，并且分泌大量IL-9，即Th9細胞。體外初始CD4+T細胞在IL-4或TGF-β單獨存在時，僅能誘導產生少量的Th9細胞，分泌較低水平的IL-9，而在IL-4和TGF-β的聯合刺激下，能夠明顯向Th9細胞分化，并分泌大量IL-9﹑IL-10，且IL-9產量與兩者劑量呈正相關。進一步研究顯示Th9細胞在分化過程中具有自分泌正反饋機制，即IL-4聯合TGF-β誘導條件下加入IL-9，可使IL-9 mRNA的表達量進一步增高[4]。來源于TGF-β受體基因缺失小鼠(TGF-βRⅡ-/-)或IL-4信號細胞內傳導分子STAT6基因缺失小鼠(STAT6-/-)的初始CD4+T細胞，分別在IL-4和TGF-β的誘導條件下培養，均不能產生IL-9，進一步證明了Th9細胞的分化有賴于IL-4和TGF-β的協同作用[4]。有學者利用非同步給予IL-4與TGF-β，研究Th9細胞分化時程中IL-4與TGF-β作用的差異，結果顯示當延后給予IL-4時，IL-9的產生輕度下降并與延后給藥時間呈線性相關，但是當延后24h給予TGF-β時，IL-9的產生則明顯下降，表明IL-4參與初始CD4+T細胞分化為Th9細胞的整個時相，而TGF-β主要在最初24h內發揮刺激分化作用[4]。

2.2 Th2細胞分化為Th9 CD4+初始T細胞在Th2誘導條件下(IL-4+抗TGF-β單抗)培養1周后，采用流式技術分選出IL-4+GATA3+Th2細胞，檢測發現這些Th2細胞表達IL-10﹑IL-13以及IL-5，但不表達IL-9。進一步將這些Th2細胞分別置于Th1誘導條件(IL-12)﹑Th2誘導條件(同上)以及Th9誘導條件(TGF-β)下培養，檢測發現在Th1誘導條件下培養后，細胞表型及細胞因子分泌并未向Th1細胞轉化，幾乎不表達T-bet，而在Th9誘導條件下培養后，IL-4﹑IL-13﹑IL-5以及GATA-3的表達明顯降低或缺失，IL-9的表達明顯升高，IL-10有少量表達，提示Th2細胞在TGF-β的條件下可經過“重組”轉變為Th9細胞[5]。Th9細胞分泌的IL-10的作用尚不明確，有研究者認為IL-10能夠促進Th9細胞的產生，其他實驗則證實Th9細胞培養過程中阻斷IL-10R并不影響IL-9的表達。事實上，IL-10并非Th2細胞所特有，某些條件下，Th1和Th17細胞亦可表達[6-7]。因此，IL-10對于Th9細胞的作用及意義尚需進一步研究。

3 Th9分化相關因子

Th細胞亞群分化及功能維持受到相對特異性的轉錄因子控制，如轉錄因子T-bet﹑GATA-3﹑Foxp3及RORγt分別為Th1﹑Th2﹑Treg及Th17細胞活化所必需的轉錄因子，據此推測Th9細胞至少存在一種特異性轉錄因子。現有資料顯示，轉錄因子PU.1﹑STAT6以及IRF4與Th9細胞關系較為密切。

3.1 轉錄因子PU.1 PU.1是ETS轉錄因子家族成員，可通過與DNA直接結合或與其他轉錄因子形成復合物的方式調節目的基因轉錄[8]。PU.1在Th1﹑Th2﹑Treg以及Th17細胞中表達較低甚至不表達，而在Th9細胞中呈明顯高表達。研究顯示，PU.1可直接連接到Th9細胞中IL-9基因的啟動子上，從而促進Th9細胞分泌IL-9[9]。同時，有文獻報道PU.1能夠干擾轉錄因子GATA-3與靶基因的結合，進而抑制Th2細胞的分化發育，這一機制可以部分解釋Th9誘導條件下Th2細胞向Th9細胞分化的現象[10]。PU.1基因敲除小鼠體內Th2免疫應答正常，但在變應原刺激下血清IL-9水平較野生型小鼠明顯降低，由Th9細胞介導的肺炎癥狀也減輕，此外，在人類分泌IL-9的T細胞中抑制PU.1的表達可使IL-9分泌明顯減少[10]。上述研究顯示，轉錄因子PU.1在Th9細胞分化和功能維持中扮演著非常關鍵的角色，是Th9細胞所必需的轉錄因子[11]。

3.2 IRF4 IRF4即干擾素調節因子4，是一種分子量為52kD的轉錄因子，在B細胞﹑T細胞﹑巨噬細胞以及樹突細胞的分化發育中發揮重要作用[12]。IRF4通常與其他轉錄因子形成復合物共同調節相關基因的活性，有時也能直接與基因啟動子上的干擾素刺激應答元件(ISRE)結合，但親和力較低。IRF4對于Th9細胞的分化非常重要。研究表明，Th9細胞中IL-9的分泌與IRF4的表達呈正相關。免疫共沉淀檢測結果顯示，IRF4能夠直接與Th9細胞中IL-9基因啟動子結合，促進IL-9基因轉錄，而IRF4基因敲除或用siRNA沉默IRF4后，CD4+初始T細胞不能分化為Th9細胞[13-14]。

3.3 STAT6 如前所述，Th細胞亞群根據所處的細胞因子環境不同而發生不同的分化。TGF-β與IL-4單獨應用分別促進Treg及Th2分化，而二者協同作用則促進Th9的分化。Goswami等[15]在研究上述現象時發現，TGF-β能夠促進PU.1表達及其與細胞核內目的基因的結合，而IL-4則主要活化STAT6。進一步研究顯示，STAT6在抑制Th9細胞內轉錄因子T-bet及Foxp3表達中發揮著重要作用。同時，STAT6能夠促進IRF4表達，后者具有促進Th9細胞分化的作用[16]。上述研究表明，STAT6也是Th9細胞分化的相關因子。

轉錄因子決定了不同細胞亞群的分化及功能，是區分不同細胞亞群的關鍵因素。進一步研究Th9特異性轉錄因子，對于明確Th9的功能及其在疾病中的作用并進行干預調控具有重要意義。

4 Th9相關疾病

4.1 Th9與哮喘 哮喘是淋巴細胞﹑嗜酸性粒細胞﹑肥大細胞等多種細胞參與的慢性氣道疾病。IL-9與哮喘發病的許多重要特征有關，如血清的IgE含量升高﹑支氣管上皮黏液分泌增加，呼吸道炎癥﹑氣道高反應性等，因此被認為是哮喘發病的重要細胞因子，在哮喘發病機制中發揮了重要作用[17]。IL-9基因位于第5號染色體長臂上(5q31-35)，與編碼IL-3﹑IL-4﹑IL-5﹑IL-13﹑CD14和粒-巨噬細胞集落刺激因子(G-CSF)的基因構成基因簇，該基因簇的多態性和連鎖不平衡與哮喘患者血清中總IgE含量大幅升高有關[18-19]。IL-9作用于患者體內的肥大細胞，一方面促進其增殖，另一方面促進肥大細胞在氣道聚集，造成了氣道對變應原的高反應性[20-22]。同時，IL-9還可以通過抑制嗜酸性粒細胞凋亡和促進IL-5介導的嗜酸性粒細胞前體成熟來增加嗜酸性粒細胞數量，增強嗜酸性粒細胞在氣道內的遷移﹑聚集；誘導中性粒細胞產生炎癥介質IL-8，增強嗜酸性粒細胞和中性粒細胞等介導的炎癥反應。IL-9還可作用于上皮細胞而導致嗜酸性粒細胞﹑T淋巴細胞浸潤，誘導上皮細胞表達產生黏蛋白，從而在哮喘炎癥的發生﹑發展過程中發揮重要作用[23-24]。

4.2 Th9與自身免疫性疾病 Th9細胞在自身免疫性疾病發病過程中的作用已經受到廣大研究者的注意，越來越多的研究表明，Th9正在成為治療自身免疫性疾病的新藥靶向細胞。在這類疾病過程中，一個重要的特征是Th9細胞與Th17細胞相互作用，協同促進疾病的發生﹑發展，Th9細胞分泌IL-9，后者促進Th17細胞分泌促炎因子IL-17﹑IFN-γ﹑IL-1和TNF等，共同介導炎癥反應，并參與這些自身免疫性疾病的病理過程[25-27]。Th17細胞在自身免疫性關節炎(RA)中具有促進效應性T細胞活化及骨質吸收的作用，即參與了RA發病的起始和骨組織破壞兩個階段，而IL-9可通過促進CD4+初始T細胞向Th17細胞分化而參與RA的發病過程。在類風濕關節炎大鼠二次免疫時，血清IL-9升高往往伴隨著轉錄因子STAT3的持續活化以及IL-17﹑TNF-α﹑IFN-γ等細胞因子的明顯上升，表明IL-9啟動了STAT3通路并促進了其他炎癥介質的表達，共同參與了RA的病理過程。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的發病過程也與IL-9有著非常密切的關系。IL-9受體缺陷以及中和IL-9能延緩疾病的發生，減輕EAE的癥狀，這與中樞神經系統中Th17細胞及分泌IL-6的巨噬細胞減少有關，同時也與外周淋巴結中肥大細胞的減少有關[28-29]。因此，抑制IL-9的活性或阻斷其表達可能會成為治療此類疾病的一個選擇。

4.3 Th9與移植排斥反應 移植排斥反應與自身免疫性疾病在某種程度上存在相似的發病機制及免疫病理損害過程，因此，有必要探討Th9細胞在排斥反應中的作用。已有研究表明，IL-9-/-受體小鼠移植物存活期較野生型小鼠明顯延長，在MHC-Ⅱ類分子不匹配的移植模型中，轉染IL-9基因的心臟供體出現急性排斥反應，伴有大量的嗜酸性粒細胞浸潤，而野生型供體并不出現急性排斥反應。我們在既往的研究中發現，小鼠心臟移植術后，排斥組移植物內IL-9 mRNA的表達水平較非排斥組明顯升高，脾臟CD4+T細胞內IL-9+Th9比例較非排斥組明顯升高。因此，研究Th 9與移植排斥反應的關系，對于進一步認識移植排斥的發生機制具有重要意義。

5 結語及展望

Th9這一新型效應性T細胞亞群的發現，打破了人們對CD4+T細胞原有分化過程的認識，為進一步闡述過敏性疾病﹑自身免疫性疾病及移植免疫反應等多種免疫疾病的發病機制提供了新思路。同時，深入研究Th9細胞的分化及功能調控機制將為上述臨床免疫疾病的治療提供新的途徑。

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