中醫藥干預脊髓損傷后基因表達實驗研究進展

王雨辰,馬 勇

(南京中醫藥大學,江蘇南京210046)

脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)是指因直接暴力或間接暴力作用在正常脊柱和脊髓組織,致損傷平面以下脊髓各項功能,包括運動、感覺、括約肌和反射功能障礙。脊髓損傷對個人及社會帶來巨大的負擔,所以研究脊髓損傷的治療具有十分重要的意義。西藥治療主要是皮質類固醇、鴉片對抗劑、利尿劑等。近年來,中醫藥實驗干預脊髓損傷是以抑制神經細胞凋亡和促進再生為主要研究方向。文章就近年來中醫藥在干預脊髓損傷后基因表達方面的基礎實驗研究做一概述,為今后的中醫藥治療脊髓損傷的研究提供參考。

1 SCI模型

SCI模型有挫傷型模型、氣囊壓迫型模型、切割型模型、光化學誘導型模型、牽拉型模型等,而壓迫型與挫傷型模型可較準確地模擬臨床SCI病理表現,并很好地呈現SCI繼發性損傷的病理變化[1]。

急性脊髓損傷模型較多采用挫傷型模型,即使用改良的Allen重物打擊法造模,王健等[2]人對分組后的SD大鼠稱重,以2%戊巴比妥鈉按30 mg/kg麻醉,消毒后以T10棘突為中心取背部后正中縱行切口。將長10 mm,寬2 mm,厚1 mm的塑料墊片按大鼠脊髓背側生理曲度屈曲預彎后,小心放置于T10處脊髓硬脊膜外,將特制的套筒嘴垂直輕放于塑料墊片正中心上,用改良Allen氏打擊裝置,以50 gcf(沖擊量為5 g重物從10 cm高度自由落下)致傷能量強度的重力打擊脊髓,以觀察到鼠尾痙攣性擺動,雙下肢及軀體回縮撲動,示建模成功。

實驗動物常選用SD大鼠、Wistar大鼠,也有少數實驗使用恒河猴或新西蘭大白兔。給藥方法:中藥提取物多用腹腔注射或靜脈注射,復方多采用灌喂方式,針灸主要是特定穴位進行電刺激。

2 中醫藥干預SCI后基因表達的實驗研究

2.1 B細胞淋巴瘤/白血病基因-2(B-cell lymphoma/leukemia 2,Bcl-2)基因家族 現代研究[3]表明Bcl-2能夠阻止或減緩多種類型細胞的凋亡。羅春山等[4]在造模(加速壓迫型Allen's打擊法造模)前后對SD大鼠靜注漢防己甲素和甲基強的松龍。免疫組化結果:漢防己甲素和甲基強的松龍可以明顯促進脊髓細胞Bcl-2的表達同時抑制Bax的表達,而兩組間在Bcl-2和Bax表達上差異無統計學意義,表明漢防己甲素在抑制神經細胞凋亡方面與甲基強的松龍作用相似。井曉磊等[5]用女貞子液治療SCI造模大鼠,結果顯示女貞子液可以明顯增強脊髓Bcl-2表達,減弱Bax表達。宋永興等[6]用Western blot方法檢測人參皂苷治療SCI大鼠后bcl-2和bax的表達,結果示各時間段大鼠脊髓中Bcl-2蛋白表達均高于損傷組(P<0.01),bax蛋白均低于損傷組(P<0.05或P<0.01),表明人參皂苷能夠明顯增加脊髓細胞Bcl-2表達,抑制bax的表達。杜長青等[7]使用中藥髓復康(生黃芪、川芎、赤芍、紅花、葛根和三七等 8味中草藥)灌喂脊髓半橫斷后的恒河猴,結果表明髓復康可以明顯促進Bcl-2蛋白表達,抑制Bax蛋白表達和脊髓神經元凋亡。素問《骨空論》云:“督脈者,貫脊,屬腎”,針刺督脈直達病所,可以活血祛瘀、溫陽通督,從而使經氣上下貫通起作用,陽氣通達,筋脈得以濡養[8]。現代研究表明電針可以阻止脊髓繼發性損傷、促進軸突再生、促進神經干細胞增殖[9]。李曉寧等[10]采用夾脊電針治療SCI大鼠,并使用原位雜交法觀察SCI后bcl-2mRNA的表達,結果顯示隨著電針治療時間的增加,電針密波組bcl-2mRNA的表達逐漸優于模型組和地塞米松組,14 d時達到高峰(P<0.01),夾脊電針通過提高bcl-2mRNA的表達來抑制脊髓損傷早期細胞凋亡,對脊髓功能的恢復起著重要作用。

2.2 半胱氨酸基天冬氨酸-特異性蛋白酶(caspase,cysteine-aspartic proteases)基因家族 caspase基因家族大部分成員都參與了細胞凋亡,其作用過程涉及的因素及信號傳導途徑非常復雜。其中Caspase-3被認為是凋亡過程最重要的蛋白酶[11],Caspase-3介導的神經細胞凋亡會導致脊髓繼發性損傷[12]。王健等[2]應用RT-PCR檢測川芎嗪對大鼠急性脊髓損傷后caspase-3mRNA表達的影響,結果發現應用川芎嗪和甲強龍后各時間點caspase-3mRNA的表達量下降,治療后caspase-3mRNA表達呈現下降的趨勢同甲強龍組接近。李曉寧等[13]采用電針刺激“心俞、脾俞”等穴位的方法治療大鼠脊髓損傷,免疫組化法檢測Caspase-9證實電針可以抑制Caspase-9在大鼠脊髓損傷神經元中表達。

2.3 熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)基因家族HSP基因家族的作用機制很復雜,它們中既有促炎癥效應的因子,也有具備抗炎癥及細胞保護的雙重作用的因子[14]。膠質瘢痕是SCI修復的阻礙因素之一[15],熱休克蛋白47(HSP47)在瘢痕纖維化的形成過程中起重要作用。何玉寶等[16]對鉗夾型SCI大鼠模型給予腹腔注射苦參素。結果:GFAP和HSP47表達降低,說明苦參素通過干預HSP47的表達阻止膠質瘢痕形成,對脊髓細胞起到保護作用。HSP70可通過抑制caspase-8的激活,減少凋亡,達到保護細胞的作用[17]。HSP70可通過抑制JNK3的激活,進而阻止Bax進入線粒體;亦可直接抑制Bid的活化,阻斷其后的凋亡通路[18]。徐維蓉等[19]采用督脈電針治療大鼠脊髓損傷并使用免疫組化法觀察HSP70的陽性表達,結果示電針治療可以增加脊髓損傷大鼠脊髓損傷部HSP70及其mRNA的表達。

2.4 白介素家族(IL,interleukin) 最近研究[20]表明SCI后細胞外谷氨酸鹽的升高能促進細胞的死亡和功能減退,而IL-1β介導了SCI后谷氨酸鹽的損害作用。提示阻斷IL-1β可能減輕脊髓繼發性損傷。Fan L等[21]采用免疫組化的觀察使用川芎嗪治療缺血性脊髓損傷大鼠IL-10和IL-1β的表達情況,結果顯示川芎嗪組較對照組IL-10明顯上調,IL-1β表達明顯減少。白細胞介素1(IL-1)是具有廣泛生物學活性的多肽,IL-1α主要參與介導炎癥反應、調節免疫及調節機體代謝,IL-1α表達減少提示炎癥反應的減弱。張瑩瑩等[22]采用針刺并電刺激“夾脊穴”和“足三里”后觀察IL-1α的表達情況,結果發現IL-1α陽性表達在傷后7 d內持續上升,傷后5 d、7 d,電刺激組IL-1α表達低于損傷組(P<0.05),這表明了針刺及電刺激可以抑制IL-1α的表達,有利于減輕脊髓炎癥反應。

2.5 神經營養因子家族(neurotrophin families,NTFs)NTFs包括神經生長因子(NGF)、腦源性神經營養因子(BDNF)、神經營養素3/4/5(NT3/4/5)、睫狀神經營養因子(CNTF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)等,它們不僅能促進正常神經細胞的生長發育,而且對損傷的神經元有預防退變和促進再生的作用。李花等[23]發現利用三七總皂苷干預脊髓全橫斷大鼠,觀察腦源性神經營養因子(BDNF)的表達較正常組增強,這表明三七總皂苷可能改善脊髓再生的微環境,促進脊髓損傷后運動功能恢復。杜旭等[24]取“大椎、命門”和“夾脊穴”兩組穴位交替電針治療治療SCI大鼠,觀察腦源性神經營養因子(BDNF)的免疫組化變化,結果顯示BDNF在電針組和甲強龍組陽性細胞數顯著強于模型對照組和空白對照組。組間沒有顯著性差異(P>0.05),表明電針治療可明顯增強SCI后BDNF的表達,促進SCI后神經的修復與再生。陳虹等[25]發現經皮電刺激“夾脊穴”及“足三里”治療脊髓損傷大鼠,能夠促進脊髓灰質神經元神經生長因子(NGF)的表達。

3 小結

綜上所述,中醫藥是具有千年歷史的傳統醫學,博大精深,同西醫治療相比,中醫藥治療具有自身優勢,通常存在劑型豐富、方法多樣、多系統多靶點的作用。相比復方制劑而言,單味中藥治療及針灸電針更容易被實驗者采納,其在相關動物實驗研究上取得的成功亦為中醫藥治療脊髓損傷提供了更廣闊的前景,如川芎(川芎嗪)目前發現其不但可以有效抑制模型大鼠caspase-3的表達[2],同時也可以有效增加IL-10的表達[21],從而對損傷脊髓起到保護作用。但中醫藥具體的作用機制尚不明確,相信隨著分子生物學的深入研究,中醫藥保護神經細胞的機制將進一步闡明,將為脊髓損傷的治療提供新的治療思路和方法。

[1]郭志寶,王偉.脊髓損傷模型的研究進展[J].神經損傷與功能重建,2009,4(2):133-135.

[2]王健,賈玉柱,鄭純威,等.川芎嗪對急性脊髓損傷大鼠神經細胞早期凋亡和Caspase-3mR NA表達的影響[J].中華中醫藥學刊,2011,29(12):2662-2668.

[3]Hideki S,Akio M.Regulation of apoptosis in nucleus pulposus cells by optimized exogenous Bcl-2 overexpression[J].J Orthop,2010,28(12):1608-1613.

[4]羅春山,田曉濱,汪雷,等.漢防己甲素對大鼠急性脊髓損傷后 bcl-2和bax表達的影響[J].第三軍醫大學學報,2010,32(12):1321-1324.

[5]井曉磊,趙鐸.女貞子對大鼠脊髓損傷后細胞凋亡及Bcl-2、Bax的表達影響[J].中國實用神經疾病雜志,2011,14(22):28-30.

[6]宋永興,金才益,曾忠友,等.人參皂甙對大鼠急性脊髓損傷的保護作用及其機制[J].海南醫學,2009,20(5):6-9.

[7]杜長青,蘇衍萍,王慧,等.中藥髓復康對恒河猴脊髓半橫斷后凋亡相關蛋白表達的影響[J].神經解剖學雜志,2010,26(2):135-139.

[8]時素華,李志剛,宋萌,等.電針對大鼠脊髓損傷后細胞凋亡受體及腫瘤壞死因子1表達的影響[J].吉林中醫藥,2011,31(1):73-77.

[9]劉麗霞,邰浩清.電針對脊髓損傷作用機制的研究[J].長春中醫藥大學學報,2011,27(3):405-406.

[10]李曉寧,宋金柱,蘇志強.夾脊電針對大鼠脊髓損傷后bcl-2mRNA表達的影響[J].哈爾濱工業大學學報,2008,40(7):1156-1158.

[11]Liu L,Pei FX,Tang KL,et al.Expression and effect of caspase-3 in neurons after tractive spinal cord injury in rats[J].Chin J Traumatol,2005(4):220-224.

[12]R.F.S RBULESCU,G.K.H.ZUPANC.Inhibition of Caspase-3-mediated apoptosis improves spinal cord repair in a regenerationcompetent vertebrate system[J].Neuroscience,2010,171:599-612.

[13]李曉寧,田旭升,劉芳.電針對大鼠脊髓損傷后細胞凋亡相關基因Caspase-9的研究[J].中醫藥信息,2009,26(1):61-63.

[14]Reddy SJ,La Marca F,Park P.The role of heat shock proteinsin spinal cord injury[J].Neurosurg Focus,2008,25(5):1-5.

[15]Xia Y,Zhao T,Li J,et al.Antisense vimentin cDNA combined with chondroitinase ABC reduces glial scar and cystic cavity formationfollowing spinal cord injury in rats[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,377(2):562-566.

[16]何玉寶,楊晨,楊有庚,等.苦參素對大鼠急性脊髓損傷后熱休克蛋白47表達的影響[J].臨床骨科雜志,2010,13(2):211-213.

[17]Arya R,Mallik M,Lakhotia SC,et al.Heat shock genes-integrating cell survival and death[J].Bioscience,2007,32(3):595-610.

[18]Stankiewiczl AR,Lachapelle G,Foo CP,et al.Hsp70 inhibits heat induced apoptosis upstream of mitochondria by preventing Bax translocation[J].JBioloChem,2005,280(46):38729-38739.

[19]徐維蓉,王強利,王奕,等.電針對脊髓損傷模型大鼠熱休克蛋白70及其mRNA的影響[J].上海針灸雜志,2009,28(9):550-553.

[20]Liu S,Xu G Y,Johnson K M,et al.Regulation of interleukin-1beta by the interleukin-1 receptor antagonist in the glutamateinjured spinal cord:Endogenous neuroprotection[J].Brain Res,2008,1231:63-74.

[21]Fan L,Wang K,Shi Z,et al.Tetramethylpyrazine protects spinal cord and reduces inflammation in a rat model of spinal cord ischemia-reperfusion injury[J].J Vasc Surg,2011,54(1):192-200.

[22]張瑩瑩,李俊岑,饒瑩,等.電刺激對大鼠脊髓損傷后神經膠質纖維酸性蛋白與白細胞介素-1α表達的影響[J].中國康復理論與實踐,2011,17(9):844-847.

[23]李花,陳安,李亮,等.三七總皂苷對脊髓損傷后 BDNF的表達及運動功能的影響[J].現代生物醫學進展,2012,12(12):2268-2271.2281.

[24]杜旭,王瑞輝.電針對脊髓損傷大鼠神經生長因子和神經功能的影響[J].針灸臨床雜志,2009,25(2):42-44.

[25]陳虹,李俊岑,黨彥麗,等.電刺激對大鼠脊髓損傷后神經生長因子表達的影響[J].中國康復理論與實踐,2012,18(1):33-36.