馬鈴薯離體莖尖玻璃化法超低溫保存

石 茹， 王 芳，3， 王 艦，3

(1.青海大學，青海 西寧810016;2.教育部青藏高原生物技術重點實驗室，青海 西寧810016;3.青海省農林科學院生物技術研究所，青海 西寧810016)

馬鈴薯屬無性繁殖，種質資源短期或中期保存通常采用在緩慢生長條件下離體保存方式，但對長期保存來說，超低溫技術則是一種比較理想的方法。液氮凍存時，幾乎所有細胞都停止代謝活動，而細胞活力和形態發生的潛能仍能保持，同時又可避免感染或污染等風險。

玻璃化法是20 世紀90 年代前后發展起來的超低溫保存新方法［1］，節省空間、操作簡便、重演性好，可以避免繁瑣的繼代培養，同時又可避免保存時體細胞發生變異［2-4］。迄今，利用玻璃化法已成功保存了李［5］、番木瓜［6］、芋頭［7］、菠蘿［8］等多種植物的離體莖尖，已有多個國家建立了馬鈴薯超低溫基因庫［9］。然而，國內馬鈴薯超低溫保存研究起步較晚，保存后的成活率較低。本研究以馬鈴薯離體莖尖為材料，在前人研究的基礎上，探尋適合馬鈴薯莖尖玻璃化法超低溫保存的最優體系，提高成活率和再生率，為長期穩定地保存馬鈴薯種質資源提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青薯9 號、大西洋、小白花、E107 試管苗由青海省農林科學院生物技術研究所提供。試管苗繼代培養在添加30 g/L蔗糖、6 g/L 瓊脂的MS 培養基(pH 5.8)上進行，培養溫度為(20 ±2)℃，光照16 h/d，光源采用冷白色熒光燈管，光照強度為3 000 lx，20 ～25 d 轉接1 次。

1.2 馬鈴薯離體莖尖玻璃化保存方法

以青薯9 號、大西洋、小白花為試驗材料，每處理10 個莖尖，3 次重復。

1.2.1 莖尖剝離 選取繼代培養30 ～40 d 的健康植株，在無菌條件下，利用雙目實體解剖鏡剝取莖尖。莖尖的葉原基個數分別為0、1、2、3 個以上，莖尖大小分別設為0 ～1.0 mm、1.1 ～2.0 mm、2.1 ～3.0 mm、＞3.0 mm。為防止莖尖干燥，剝離后立即置于0.1 mol/L 蔗糖的MS 培養液中。

1.2.2 莖尖預培養 將剝離好的莖尖放在培養液(MS+0.04 mg/L KT+0.10 mol/L 蔗糖，pH 5.8，過濾滅菌)中進行預培養。預培養時間分別設0 h、2 h、4 h、6 h、24 h。

1.2.3 裝載 將經過預培養的莖尖在室溫下用裝載液(MS +2.0 mol/L 甘油+0.4 mol/L 蔗糖，pH 5.8，高溫滅菌)進行裝載處理。裝載時間分別設0 min、20 min、40 min、60 min、80 min。

1.2.4 脫水處理 裝載處理后，用經過0 ℃預冷的PVS2(Plant vitrification solution 2)進行脫水處理，脫水時間分別設0 min、25 min、30 min、35 min、40 min、45 min、50 min、60 min。整個過程必須在0 ℃下進行。

1.2.5 液氮保存 莖尖經過以上處理后，裝入1.8 ml 冷凍管中，加少許新鮮的PVS2溶液，注入液氮，蓋上蓋子，迅速投入液氮罐中保存，保存時間不少于24 h。

1.2.6 解凍處理和再培養 從液氮中取出保存材料，室溫下浸入恢復培養液(MS +1.2 mol/L 蔗糖，pH 5.8)中90 s 迅速解凍，然后吸出混合液體，加入恢復培養液，輕微混勻，在第5 min、15 min 時更換新的恢復培養液，第25 min 取出莖尖放置在濾紙上數秒，轉接在恢復培養基中，(17 ±1)℃下暗培養10 d后，轉入弱光條件下培養20 d，再轉入正常光照下培養。半個月后統計成活率(莖尖轉為綠色的材料占試驗材料總數的百分率);1 個月后統計再生率(葉原基展開即莖尖長芽的材料占試驗材料總數的百分率)，再生植株移入溫室內栽培。

1.3 利用正交設計優化超低溫保存體系

以青薯9 號為試驗材料，對4 個主要影響因素:莖尖大小、預培養時間、裝載時間、脫水時間進行正交設計，探討四者結合對玻璃化法超低溫保存馬鈴薯離體莖尖成活率的影響。按照正交表L9(34)設計各因素及水平(表1)，每處理10 個莖尖，3 次重復。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal test

1.4 遺傳穩定性檢測

參照Ghislain 等［10］的方法對超低溫保存后再生植株的遺傳穩定性進行SSR 檢測。參照邸宏等［11］的CTAB 方法，對4 個品種的試管苗和超低溫保存后的再生苗各10 株提取DNA。DNA 用ddH2O稀釋至50 ng/μl備用。

所有引物均由上海生工生物工程技術有限公司合成。PCR 反應體系為20.0 μl，包含10 ×PCR buffer 2.0 μl、dNTPs(10 mmol/L)0.8 μl、Taq 酶(2.5 U)0.3 μl、SSR 引物(10 μmol/L)各1 μl、模板DNA 1.0 μl、ddH2O 13.9 μl。PCR 反應中所用Taq 酶、dNTP、PCR buffer 購自天根公司。SSR 擴增程序為:95 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃(不同引物有差別)退火45 s，72 ℃延伸90 s，35 個循環;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR 擴增產物采用12%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，恒定電壓120 V，電泳3 h。銀染法檢測并統計電泳結果。

1.5 數據統計分析

數據利用SAS 9.1 和Excel 軟件統計分析，采用鄧肯氏新復極差測驗法進行多重比較。

2 結果

2.1 正交試驗結果

由表2 可知，在9 組配比設計中，第9 個處理的成活率最高，達到60.28%;第6 個處理成活率最低，僅為26.12%。統計分析結果顯示，正交試驗的4 因素各水平間均存在極顯著差異，影響因素順序為PVS2 脫水時間＞裝載時間＞莖尖大小＞預培養時間。T 值分析表明，獲得保存后最高成活率的最優配比組合應為A3B2C2D1，即2.1 ～3.0 mm 的馬鈴薯莖尖預培養4 h，室溫下裝載液裝載40 min，0 ℃PVS2脫水處理35 min。

表2 正交試驗結果Table 2 The results of orthogonal test

2.2 玻璃化法超低溫保存中單因子試驗分析

進行單因子試驗時，利用正交試驗結果，只變化單因子，其他處理按最佳組合進行。

2.2.1 莖尖大小 研究結果(圖1)表明，甘薯莖尖大小對超低溫保存后的成活率具有顯著影響。隨著莖尖從小到大，成活率先增加后減少，當莖尖大小增加到2.1 ～3.0 mm 時，即帶有2 個葉原基時成活率最高，青薯9 號、大西洋、小白花分別為68.60%、57.50%、63.20%;大于3.0 mm 的莖尖(3 個以上葉原基)成活率明顯下降。

圖1 莖尖大小對甘薯成活率的影響Fig.1 Effects of tips sizes on the survival rates of potato

2.2.2 預培養時間 研究發現預培養時間對甘薯莖尖保存后的成活率影響顯著。預培養4 h 平均成活率最高，不進行預培養成活率均最低。預培養時間過長或過短都會導致成活率明顯下降。本試驗條件下，預培養的適宜時間為2 ～6 h，以4 h 為最佳(圖2)。

圖2 預培養時間對甘薯成活率的影響Fig.2 Effects of preculture time on the survival rates of potato

2.2.3 裝載液時間 結果顯示，大西洋莖尖預培養4 h 后未進行裝載處理，成活率最低(20.40%);隨裝載液處理時間延長成活率不斷提高，當莖尖在裝載液中處理40 min 時，青薯9 號、大西洋、小白花保存后成活率均最高，分別為63.20%、58.20%、60.00%。但隨著時間繼續延長，成活率顯著下降，表明裝載時最佳處理時間為40 min(圖3)。

圖3 裝載液預處理對甘薯成活率的影響Fig.3 Effects of time duration for loading buffer on survival rates of potato

2.2.4 PVS2處理 將2.1 ～3.0 mm 的莖尖預培養4 h、裝載處理40 min 后脫水，發現未經PVS2處理的莖尖全部死亡，PVS2處理35 min 成活率最高，顯著高于其他處理時間。但隨處理時間的延長，成活率又迅速下降(圖4)。表明PVS2處理時間在30 min至40 min 之間比較合適，35 min 效果最佳。

圖4 PVS2 處理時間對甘薯成活率的影響Fig.4 Effects of time exposed to PVS2 on the survival rates of potato

2.3 玻璃化法超低溫保存后的形態發生和植株再生

將保存的材料從液氮中取出，迅速解凍并洗滌后，接種到恢復培養基(MS +30 g/L 蔗糖+0.05 g/L EDTA+0.50 mg/L IAA+0.04 mg/L KT+0.10 mg/L GA3)上(圖5A)。莖尖解凍后轉接在再生培養基中，先進行10 d 的暗培養，然后過度轉移至正常光照下，可顯著提高其存活率。半個月后一部分莖尖呈白色或褐變;一部分莖尖愈傷化，分生組織和葉原基無序生長，最后死亡;大部分莖尖則直接成芽(圖5B ～D)。再生芽可在生根培養基上誘導生根(圖5E、F)。馬鈴薯較易生根，將超低溫保存后的形成再生苗轉接于MS 培養基上進行繼代培養，7 d 左右即有根長出，且植株健壯，再生植株在形態上與對照無異(圖5G、H)。待有7 ～8 條根時，將發育良好的植株經煉苗后移栽到溫室，大西洋、青薯9 號、小白花成活率分別為86.67%、100.00%、93.33%。

2.4 液氮凍存時間對成活率的影響

將青薯9 號的離體莖尖處理后于液氮中分別凍存1 d、7 d、30 d、60 d，然后進行恢復培養。方差分析結果顯示液氮凍存時間對超低溫保存后再生植株的成活率無顯著影響(表3)。

2.5 再生植株遺傳穩定性分析

用30 對引物組合對超低溫保存前后的馬鈴薯莖尖進行PCR 擴增，從中篩選出譜帶清晰并呈現多態性的有效引物共10 對。對這10 對引物PCR擴增的譜帶進行分析，結果顯示:10 對引物組合共擴增出314 條帶，不同引物的擴增條帶數從6 條至30 條不等，其中青薯9 號有270 條帶，大西洋有275 條帶，小白花有239 條帶，E107 有280 條帶。超低溫保存前后的馬鈴薯之間未見明顯差異條帶(圖6、圖7)，這表明甘薯莖尖超低溫保存沒有發生遺傳變異。

3 討論

玻璃化法超低溫保存是目前長期而穩定地保存植物種質資源較為理想的方法。從理論上來說，在液氮低溫下，植物材料不會發生遺傳性狀的改變，并且可以無限期保存［12-14］。本試驗中，馬鈴薯莖尖保存60 d 的成活率和再生率與保存24 h 無顯著差異。但有關馬鈴薯種質資源的長期保存，目前還在進行深入的研究。

材料的選擇是影響超低溫保存效果的直接因素。莖尖具有旺盛的恢復生長的能力，但莖尖大小會影響脫水的難易程度，莖尖過大不利于脫水，導致玻璃化程度不夠而影響保存后的成活率;莖尖過小，容易脫水，但不易于再生，而且冷凍保護劑對材料的毒害也比較大。Niino 等也認為PVS2處理時間與莖尖大小有關系，一般為十幾分鐘到幾個小時［15］。本試驗結果表明，帶有2 個葉原基的莖尖成活率明顯升高，過大過小都會使成活率顯著下降。此外，由于基因型不同，不同資源帶有2 個葉原基的莖尖大小也有差異，稍做調整即可。

圖5 青薯9 號莖尖超低溫保存后的植株再生過程Fig.5 The plantlet regeneration process of Qingshu 9 after cryopreservation

表3 液氮凍存時間對甘薯莖尖成活率的影響Table 3 Effects of different preservation times in liquid nitrogen on survival rates of potato shoot tips

超低溫保存前進行預培養和裝載處理，目的是增強細胞分裂與分化的同步化，促進脫水，增加含糖量，提高胞液的滲透勢，降低冰點，這樣能夠減少凍存過程中水分結冰對細胞膜的傷害，提高保存后的成活率［16-17］。但處理時間過短或過長都會對成活率有影響，過短則脫水不徹底;過長則蔗糖對細胞產生滲透脅迫，造成傷害，降低成活率。本研究預培養后成活率上升的原因可能是預培養液中加入了KT，有利于莖尖細胞分裂，從而使莖尖更易于成活［18］。

圖6 SSR 引物對E107、大西洋試管苗和超低溫保存后再生苗的擴增情況Fig.6 DNA fingerprint of E107 and Daxiyang regenerated plants detected by SSR primers STM2030，STM1053 and STM3023a before and after cyropreservation

圖7 SSR 引物對小白花、青薯9 號試管苗和超低溫保存后再生苗的擴增情況Fig.7 DNA fingerprints of Xiaobaihua and Qingshu 9 regenerated plants detected by SSR primers STM2030，STM1053 and STM3023a before and after cryopreservation

此外，恢復培養時光照條件以及時間長短也是影響存活率的重要因素。本研究發現馬鈴薯莖尖解凍后再培養時，要使微小莖尖或頂端分生組織存活，則需要較長的恢復期，且對黑暗條件要求嚴格。暗培養3 d 或7 d 的莖尖見光后都會變成白色，很難存活，暗培養10 d 后緩慢過度到正常光照條件下，莖尖才能存活。這與桃［19］和藥用草本植物皖貝母［20］相似，也與王子成等超低溫保存脫除馬鈴薯病毒研究中的結果［21］一致。

本研究結果表明，馬鈴薯莖尖玻璃化法超低溫保存后的成活率可達60%以上，并且再生植株從形態和分子水平上都較好地保持了遺傳穩定性，未出現遺傳變異，為馬鈴薯種質資源的長期保存提供了理論依據和技術支撐。

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