江蘇草莓灰霉病菌對5 種殺菌劑的抗藥性

潘以樓， 朱桂梅， 郭 建

(江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所，江蘇 句容212400)

灰霉病是由葡萄孢屬真菌引起的一種世界性的重要病害［1-2］。草莓灰霉病是草莓上為害最普遍、最嚴重的病害之一，一般減產10.0% ～30.0%，重者達50%以上［3］。迄今為止，尚未發現對草莓灰霉病具有抗性的品種［4］。目前生產上主要應用多菌靈、腐霉利、乙霉威、異菌脲、嘧霉胺等殺菌劑控制草莓灰霉病［5-6］?；颐共【蚓哂屑闹鞣秶鷱V、繁殖快和遺傳變異頻繁等特點，使其極易對殺菌劑產生抗性［4］。據報道，草莓灰霉病菌對多菌靈［7］、腐霉利［8］、異菌脲［9］、乙霉威［10］均已產生抗藥性，其中對多菌靈抗藥性較強。嘧霉胺在蔬菜上應用的時間不長，但番茄等茄科蔬菜灰霉病菌對其也產生了抗藥性［11-12］;本世紀初，嘧霉胺開始在江蘇草莓種植區使用，2007 年浙江省2 個地區草莓灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性為24%［13］，到目前為止江蘇地區草莓灰霉病菌對嘧霉胺抗藥性發生狀況還未見報道。

雖然已有研究報道草莓灰霉病菌對多菌靈、腐霉利、異菌脲、菌核凈、乙霉威存在抗藥性［7-9］，其中對多菌靈抗性菌株的分布有比較詳細的研究［7］，而對腐霉利、異菌脲、菌核凈、乙霉威抗性菌株的分布還未見詳細報道。

為了明確江蘇草莓灰霉病菌對殺菌劑抗藥性的現狀，筆者在2011 ～2012 年在江蘇草莓主產區采集、分離草莓灰霉病菌菌株，在室內測定這些菌株對嘧霉胺、多菌靈、腐霉利、異菌脲、乙霉威的敏感性，為草莓灰霉病的防治提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2011 年和2012 年5 月，在江蘇草莓主產區句容市天王鎮、句容市白兔鎮、宜興市宜城鎮、盱眙縣三河鎮和東海縣黃川鎮采集草莓灰霉病病果，用滅菌的木質牙簽輕觸病果上灰霉病菌霉層，迅速放入馬鈴薯蔗糖培養基(PSA)斜面上帶回實驗室。一個病果作為一個菌株，用PSA 培養基進行單孢純化后轉至PSA 斜面上，保存于4 ℃冰箱中供試。

1.2 培養基

PSA 培養基［14］用于草莓灰霉病菌分離、菌株保存及草莓灰霉病菌對多菌靈、腐霉利、異菌脲和乙霉威的敏感性測定。

Chapeland 培養基［11，15］用于草莓灰霉病菌對嘧霉胺的敏感性測定。

1.3 供試藥劑

95.0 %嘧霉胺(Pyrimethanil)原藥，由江蘇豐登農藥有限公司生產;96.0%多菌靈(Carbendazim)原藥，由上海升聯化工有限公司生產;98.0%腐霉利(Procymidone)原藥，由江西禾益化工有限公司生產;96.2%異菌脲(Iprodione)原藥，由江蘇快達農化股份有限公司生產;95.0%乙霉威(Diethofencarb)原藥，由江蘇蘇化集團新沂農化有限公司生產。

多菌靈原藥用0.1 mol/L HCl 溶液溶解成1 000 μg/ml母液。其他原藥均用少量丙酮溶解原藥配制成1 000 μg/ml 的母液，并在母液中加入2.0%Tween-80 作為乳化劑。

1.4 草莓灰霉病菌對嘧霉胺的敏感性測定

采用菌絲生長速率法測定草莓灰霉病菌對嘧霉胺的敏感性［16］。用滅菌蒸餾水稀釋嘧霉胺母液制成系列濃度的藥液，并加入45 ℃Chapeland 培養基中制成最終含藥量為0 μg/ml、0.003 2 μg/ml、0.016 0 μg/ml、0.080 0 μg/ml、0.400 0 μg/ml、2.000 0 μg/ml、10.000 0 μg/ml的含藥平皿。從PSA 平板上培養3 d 的草莓灰霉病菌菌落邊緣，取直徑為5 mm的菌碟，并把其菌絲面向下接種于含藥平板上，每皿1 個菌碟，每處理3 次重復。于25 ℃培養4 d 后，用十字交叉法量取菌落直徑(mm)，取平均值后再減去原菌碟直徑(5 mm)后，計算抑制率，抑制率=［(未加藥處理的菌落直徑－加藥處理的菌落直徑)/未加藥處理的菌落直徑］×100%。

采用幾率值法，通過濃度對數值(x)和抑制率機率值(Y)之間的線性回歸關系，計算嘧霉胺對草莓灰霉病菌各菌株的抑制中濃度(EC50)。

1.5 草莓灰霉病菌對多菌靈、腐霉利、異菌脲和乙霉威的抗性檢測

采用最低抑制濃度法(MIC)檢測草霉灰霉病菌對各藥劑的抗藥性［7］。多菌靈的鑒別濃度設置為5.000 0 μg/ml［7］，異菌脲的鑒別濃度設置為5.000 0 μg/ml［9］，乙 霉 威 的 鑒 別 濃 度 設 置 為0.500 0 μg/ml［10］，腐 霉 利 的 鑒 別 濃 度 設 置 為10.000 0 μg/ml［10］。PSA 培養基在55 ℃時加入各藥劑，分別制成含多菌靈5.000 0 μg/ml、異菌脲5.000 0 μg/ml、乙霉威0.500 0 μg/ml、腐霉利10.000 0 μg/ml的含藥平皿。將待檢測的灰霉病菌各菌株在PSA 平皿上培養3 d 后取直徑為5 mm 的菌片移至各含藥平皿上，在25 ℃下培養3 d，不能或幾乎不能在該鑒別濃度上正常生長的為敏感菌株，能正常生長的為抗性菌株。

1.6 數據分析

所有計算均用DPS 軟件進行，并用Excel 進行數據相關性分析和制圖。

2 結果

2.1 草莓灰霉病菌對嘧霉胺的敏感性分布

2011 年采集的草莓灰霉病菌133 個菌株對嘧霉胺的敏感性差異較大，嘧霉胺抑制灰霉病菌菌絲生 長 的EC50值 最 低 為0.015 9 μg/ml，最 高 為14.134 9 μg/ml。嘧霉胺對2012 年采集的草莓灰霉病菌206 個菌株抑制菌絲生長的EC50值為0.012 5 ～20.195 5μg/ml。2011 和2012 年采集的草莓灰霉病菌菌株對嘧霉胺的敏感性(EC50值)分布表現為敏感菌株比例和高抗菌株比例較高，而中間的低抗菌株較少。

2.2 草莓灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性

2011 年和2012 年在江蘇5 個草莓產區分別采集133 個菌株和206 個菌株，檢測這些菌株對嘧霉胺的敏感性，按照嘧霉胺抑制菌絲生長的抑制中濃度(EC50值)大小區分菌株對嘧霉胺的抗性程度。菌株對嘧霉胺抗性程度依據紀明山等［17］所報道的灰霉病菌對嘧霉胺的敏感基線值(0.0911 0 μg/ml)進行判別，當菌株EC50值小于敏感基線值5 倍，即EC50值小于0.455 5 μg/ml 為敏感菌株;當菌株的EC50值處于敏感基線值5 ～10 倍，即EC50值在0.455 5 ～0.911 0 μg/ml 為 低 抗 菌 株;當 菌 株 的EC50值 處 于 敏 感 基 線 值10 ～40 倍，即EC50在0.911 0 ～3.644 0 μg/ml為中抗菌株;當某菌株的EC50值大于敏感基線值40 倍，即EC50高于3.644 0 μg/ml為高抗菌株［18］。結果(表1)顯示，2011 年133 個菌株中，對嘧霉胺敏感菌株占22.6%，對嘧霉胺低抗菌株、中抗菌株和高抗菌株分別占15.8%、39.1%和23.3%;2012 年206 個菌株中，對嘧霉胺敏感菌株占34.0%，對嘧霉胺低抗菌株、中抗菌株和高抗菌株分別占1.0%、5.8%和59.2%。檢測結果表明，在江蘇草莓主產區，草莓灰霉病菌對嘧霉胺已產生較高的抗藥性，抗性菌株比例在2011 年和2012 年分別達到77.4%和66.0%。

表1 江蘇5 個草莓產區草莓灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性Table 1 Resistances of B. cinerea from strawberry in 5 regions of Jiangsu to pyrimethanil

從5 個地點采集的草莓灰霉病菌菌株來看，宜興市宜城區草莓灰霉病菌對嘧霉胺抗藥性菌株所占比例最高，2011 年和2012 年抗性菌株所占比例分別為100%(9.1% +39.4% +51.5%)和90.2%(0 +2.0%+88.2%)，且絕大多數菌株為中抗和高抗菌株;東?？h黃川鎮草莓灰霉病菌對嘧霉胺的抗性株比例最小，2011 年和2012 年抗性菌株所占比例分別為55.5%(14.8% +37.0% +3.7%)和43.4% (0 +3.8% +39.6%)(表1)。2 年的檢測結果表明，草莓灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性有明顯的地域差異，這可能與各地嘧霉胺的使用年限和施藥量有一定的相關性。

2.3 草莓灰霉病菌對多菌靈、腐霉利、異菌脲和乙霉威的抗藥性

2012 年從江蘇5 個草莓主產區采集的206 個灰霉病菌菌株，采用最低抑制濃度法(MIC)檢測這些菌株對多菌靈、腐霉利、異菌脲和乙霉威的抗藥性。結果(表2)顯示，在206 個菌株中，抗多菌靈、腐霉利、異菌脲和乙霉威的菌株分別占67.5%、11.2%、63.6%和59.7%，其中灰霉病菌對腐霉利的抗藥性菌株所占比例最小。表明，在江蘇草霉產區，應用異菌脲、多菌靈、乙霉威防治灰霉病的防病效果較低，已無實用價值。

表2 草莓灰霉病菌對5 種殺菌劑的抗藥性Table 2 Resistance of B. cinerea from strawberry to five fungicides

2.4 草莓灰霉病菌對5 種殺菌劑抗藥性的表現型

2012 年采集的206 個草莓灰霉病菌菌株，根據它們對多菌靈、腐霉利、異菌脲、乙霉威和嘧霉胺這5 種殺菌劑的抗、感性程度，可以分為17 種表現型(表3)。對多菌靈、異菌脲、嘧霉胺表現抗藥性及對腐霉利、乙霉威表現敏感的菌株有63 個，所占比例為30.6%;對多菌靈、異菌脲、嘧霉胺、乙霉威表現抗藥性及僅對腐霉利表現敏感的菌株有45 個，所占比例為21.8%;對乙霉威表現抗藥性及對多菌靈、異菌脲、腐霉利和嘧霉胺表現敏感的菌株有20 個，占9.7%;對多菌靈、腐霉利、異菌脲表現敏感及對乙霉威和嘧霉胺表現抗性的菌株有17 個，占8.3%;對多菌靈、乙霉威、嘧霉胺表現抗藥性及對腐霉利和異菌脲表現敏感的菌株13 個，占6.3%;其他表現型的菌株數均在10 個以下，所占比例較低。

表3 草莓灰霉病菌對5 種殺菌劑抗藥性的表現型Table 3 Resistance types of B. cinerea from strawberry to five fungicides

3 討論

3.1 草莓灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性

嘧霉胺在蔬菜和草莓上用于防治灰霉病已有十多年，在蔬菜灰霉病菌，特別是番茄灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性已有許多報道［11-12，17-18］，而草莓灰霉病菌對嘧霉胺抗藥性研究卻鮮有報道。我們2011 ～2012 年的研究結果表明，在江蘇草莓主產區，草莓灰霉病菌對嘧霉胺也產生了較高的抗藥性，2011 年和2012 年抗性菌株的比例分別達到77.4% 和66.0%。表明，生產上應用嘧霉胺防治草莓灰霉病的防治效果較低，應篩選新的殺菌劑用于草莓灰霉病的防治。

3.2 草莓灰霉病菌對多菌靈、腐霉利、異菌脲、乙霉威的抗藥性

2012 年我們應用MIC 法測定了206 個草莓灰霉病菌菌株對多菌靈、腐霉利、異菌脲和乙霉胺的抗藥性，結果表明抗多菌靈、腐霉利、異菌脲和乙霉威的菌株分別占67.5%、11.2%、63.6% 和59.7%。表明，在江蘇草莓主產區，草莓灰霉病菌對多菌靈、異菌脲、乙霉威均產生了較高的抗藥性，應用這3 種藥劑防治草莓灰霉病意義不大。

3.3 殺菌劑的交互抗藥性

據報道，乙霉威與多菌靈存在負交互抗性［19］。本檢測結果表明，在166 個抗多菌靈的菌株中，74個菌株對乙霉威仍表現抗性，92 個對乙霉威表現敏感。這可能與灰霉病菌對多菌靈抗性的突變位點不同有關［20］。異菌脲和腐霉利同屬于二甲酰亞胺類殺菌劑，其作用機理可能是通過滲透壓傳導途徑發揮抑菌作用，這2 種殺菌劑間存在交互抗性［13］。在本試驗檢測的206 個菌株中，對異菌脲和腐霉利均表現敏感的有71 個菌株;對這2 種殺菌劑均表現抗性的有20 個菌株;而對異菌脲表現抗性及對腐霉利表現敏感的有112 個菌株;對異菌脲表現敏感及對腐霉利表現抗性的有3 個菌株。表明，草莓灰霉病菌對同屬二甲酰亞胺類的殺菌劑并不完全表現交互抗藥性，其機理還有待進一步研究。

3.4 草莓灰霉病菌對殺菌劑的多重抗藥性

草莓灰霉病菌對多菌靈、乙霉威、腐霉利、異菌脲的室內誘變抗性菌株和田間抗性菌株報道較多［7-10］，對多菌靈和乙霉威［10］、多菌靈和異菌脲［21］、多菌靈和腐霉利［22］的雙抗菌株也有報道，而對多種殺菌劑的多重抗性菌株的報道還較少。我們2012年測定206 個草莓灰霉病菌菌株對多菌靈、乙霉威、腐霉利、異菌脲和嘧霉胺抗藥性，沒有檢測到對這5種殺菌劑均敏感的野生菌株;對這5 種殺菌劑均表現抗性的多重抗性菌株6 個，占2.9%;4 重抗性菌株61 個，占29.6%;3 重抗性菌株77 個，占37.4%;雙重抗性菌株34 個，占16.5%;單抗菌株28 個，占13.6%。原因可能是草莓灰霉病防治中，所使用殺菌劑種類較多，田間出現多重抗性的菌株比例上升。

3.5 防治草莓灰霉病新殺菌劑的篩選

本研究結果表明草莓灰霉病菌對目前生產應用的5 種殺菌劑均產生了抗藥性，這是近年來這些藥劑對草莓灰霉病防治效果下降的主要原因。許多研究者也在篩選新殺菌劑用于草莓灰霉病的防治，如啶酰菌胺(Boscalid)、咯菌腈(Fludioxonil)對草莓灰霉病菌具有較高的毒力和較好的田間防病效果［23-25］;嘧菌環胺(Cyprodinil)對葡萄灰霉病菌具有較高抑菌活性和田間防病效果［26］，嘧菌環胺抑制123 個草莓灰霉病菌菌株菌絲生長的平均EC50值為(0.028 3 ±0.005 3)μg/ml。這些新殺菌劑在草莓灰霉病防治中的應用，首先要考慮這些新殺菌劑與目前生產上應用的殺菌劑是否存在交互抗性，以及這些新藥劑的抗藥性風險。

植物病原菌對殺菌劑的抗性風險是由藥劑和病菌共同決定的，如藥劑的選擇壓力和作用機制、病菌自身的抗藥性頻率、抗藥性突變體的適合度和交互抗性等［27］。在沒有明確草莓灰霉病菌對這些新殺菌劑抗性風險情況下，在應用中應該遵循殺菌劑使用準則，與其他不同作用機制的殺菌劑輪換使用或交替使用，以延緩病菌抗藥性的產生。

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