水牛生長分化因子9 成熟肽基因克隆及重組蛋白質和多克隆抗體的制備

劉玉鵬， 彭中友， 郭日紅， 雷明明， 于建寧， 陳瑞愛， 施振旦

(1.廣東省獸用生物制品生物技術研究與應用企業重點實驗室，肇慶大華農生物藥品有限公司，廣東 肇慶526238;2.華南農業大學動物科學學院，廣東 廣州510642;3.江蘇省農業科學院畜牧研究所，江蘇 南京210014)

生長分化因子9(Growth differentiation factor9，GDF9)，是轉化生長因子-β(Transforming growth factor-β，TGFβ)超家族的一員，在動物卵巢組織中高水平表達，是最先被發現的對卵泡發育有重要調控作用的細胞因子［1］。卵泡的發育需要GDF9 的調控，由卵母細胞分泌的GDF9 促進卵泡的正常發育。母羊GDF9 基因純合突變導致體內缺乏GDF9，則母羊的卵泡發育停留在初級卵泡階段而不能發育至次級卵泡階段，導致母羊不育［2-3］。但GDF9 基因雜合突變體母羊，雖然其體內GDF9 生成量僅及野生型羊的一半，但初級卵泡向次級卵泡的發育不受影響，而有腔卵泡的成熟提前發生，包括提高了卵泡顆粒細胞對促卵泡激素(FSH)的反應性、以及在較早發育時期的顆粒細胞就表達促黃體素受體(LHR)和較早就具有合成和分泌孕酮的能力，從而在較早發育時期就能夠對排卵前促黃體素(LH)高峰作出反應，導致排卵數和產羔數的增加［4］。因此可以通過免疫GDF9 的方法人為調控體內GDF9 的生物學活性，如長期或重度免疫使抗體能夠中和抑制體內絕大部分GDF9，將使具有正常生殖機能的母羊的卵泡發育停留在初級階段而不能發育至次級卵泡階段以上而導致羊的不育;而如果僅是輕度免疫GDF9使產生的抗GDF9 抗體效價較低，則可以提高正常羊的排卵數和產羔數［2，5］。因此通過基因工程獲得GDF9 蛋白質作為免疫原，用于免疫母羊或其他動物，則理論上有可能促進卵泡提前發育成熟和提高排卵數，最后用于開發提高羊繁殖力的新技術。

此外，在對卵子體外成熟和胚胎的體外生產研究中，還發現卵子分泌的GDF9 能夠影響周圍的卵丘細胞的發育和功能［6-7］。通過卵子與卵丘細胞之間雙向交流促進卵子的成熟和受精后早期胚胎的發育質量。如在小鼠卵子體外成熟培養液中添加外源GDF9 能促進卵丘細胞的擴散［8］，提高卵子質量和顯著促進胚胎的發育以及提高胚胎移植后胎兒的成活率［7，9］。將能夠分泌GDF9 的裸卵加入卵子的培養體系中后，也可以大幅提高囊胚率和早期胚胎的發育質量［10-12］。因此目前國內大范圍開展的以現代胚胎生物技術為基礎的動物轉基因研究中，可能需要使用GDF9 以提高卵子的IVM(體外成熟)、胚胎(包括克隆胚)的生產數量和質量以及移植后的轉基因動物生產效率。

本研究首先克隆水牛GDF9 成熟肽cDNA 序列，然后利用原核表達其重組蛋白質并進一步制備抗體，以應用于提高羊繁殖性能新技術開發和促進動物卵子IVM、胚胎體外生產和轉基因動物研究。

1 材料和方法

1.1 載體和菌株

pMD18-T 載體購自TaKaRa 公司，E. coli DH5α、E.coli BL21(DE3)和pRSET-A 由華南農業大學動物科學學院動物生殖生理學實驗室保存。

1.2 試劑和酶類以及實驗動物

限制性內切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ、Ex Taq DNA聚合酶、DL2000 分子量標準、T4 連接酶及膠回收試劑盒均為TaKaRa 公司產品。用于純化的帶His-tag的50% Ni-NTA 凝膠(Qiagen)購自基因公司。用于純化GDF9 多克隆抗體的Protein A Sepharose 購自北京康為世紀生物公司。辣根過氧化酶(HRP)標記羊抗兔IgG 購自北京鼎國生物技術有限公司。新西蘭大白兔購自南方醫科大學實驗動物中心。

1.3 水牛GDF9 成熟肽基因序列的克隆以及重組蛋白質的表達和純化

根據水牛GDF9 基因編碼區的核苷酸序列(GenBank:FJ529501.1)設計并由上海英駿公司合成1 對引物。上游引物Up 序列為:5'-TTCGGATCCGACCAGGAGAGTGTCAGCT-3'，含 有BamHⅠ酶切位點(下劃線部分);下游引物Down 序列為:5'-GACAAGCT TTACTTTGTGG CTATCATATCTTC -3'，含有Hind Ⅲ酶切位點(下劃線部分)，加粗堿基為終止密碼子。

將水牛基因組DNA 作為模板，用引物Up 和Down 進行PCR 擴增，并將擴增得到的396 bp 的GDF9 片段克隆入pMD18-T 載體構建重組質粒pGDF9，并將pGDF9 轉化入E. coli DH5α 株增殖復制。

抽提pGDF9 并用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切，經凝膠電泳分離回收GDF9 cDNA 片段，并克隆入表達載體pRSET-A 的BamH Ⅰ和Hind Ⅲ兩位點之間，構建pR-GDF9。將pR-GDF9 轉化E. coli BL21(DE3)，用IPTG 誘導表達GDF9 重組蛋白質。經SDS-PAGE 驗證蛋白質的表達和分子大小之后，用50%Ni-NTA 凝膠在變性條件下進行純化。

1.4 GDF9 多克隆抗體的制備和純化

將純化并透析復性后的GDF9 重組蛋白質與礦物油混合制成含1 mg/ml 重組蛋白質的油乳劑，并對新西蘭大白兔進行肌肉及皮下多點注射此油乳劑1 ml 進行免疫。經過連續3 次間隔14 d 的免疫注射之后，在第3 次免疫后10 d 頸動脈放血收集全血并使之凝固。然后離心分離血清，用飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白IgG 之后，進一步用Protein A Sepharose 純化多克隆抗體，純化抗體保存于-20 ℃。

1.5 ELISA 檢測抗血清效價

將GDF9 抗原稀釋至濃度為10 μg/ml包被96微孔酶標板，每孔加入100 μl，4 ℃包被過夜，于次日倒掉包被液，用洗滌液(0.05% Tween +PBS)洗3次;加5% BSA-PBS 于37 ℃封閉1 h，洗滌3 次后依次加免疫血清、HRP 抗兔IgG (1∶ 4 000稀釋)，洗滌步驟同前;加底物TMB，37 ℃顯色25 min，加2 mol/L硫酸終止反應后，讀取450 nm 吸光值。

1.6 15 個物種間GDF9 基因成熟肽同源性分析

從GenBank 獲取15 種動物GDF9 基因cDNA序列信息，包括黃牛、綿羊、山羊，豬、鼠、人和兔等。用Mega4.1 軟件［13］對15 個物種的GDF9 基因成熟肽進行同源性分析以構建進化樹。

2 結果與分析

2.1 水牛GDF9 成熟肽基因的克隆和同源性分析

以水牛基因組DNA 為模板，用引物Up 和Down擴增出1 條大約396 bp 的片段，再克隆入質粒pMD18-T 載體并在E.coli DH5α 株增殖復制后測序，確認為GDF9 成熟肽基因序列。

所擴增的水牛GDF9 成熟肽基因與牛的同源性最高，達到98%，而與斑馬魚的同源性最低，僅34%，與其他反芻動物如山羊、中國麝香鹿和綿羊的也高度同源，分別達到94.9%，94.7% 和94.7%。從進化樹(圖1)可以看出15 個物種分類為2 大類，即哺乳類和魚類。哺乳動物又可以分為4 類:水牛和黃牛聚為最近的一類，山羊和綿羊聚為一類，繼而他們與中國麝香鹿聚為一類，形成反芻動物類。

2.2 水牛GDF9 基因在E.coli BL21(DE3)中的表達及純化

所構建的表達載體pR-GDF9 用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切，產生1 條約396 bp 的片段及1 條約2 876 bp 的載體片段。另將pR-GDF9 測序，結果顯示GDF9 基因序列片段已經正確插入載體并維持了正確的閱讀框架。

轉化重組質粒pR-GDF9 的E. coli BL21(DE3)株在LB(AMP +)液體培養基中培養并經IPTG 誘導后，表達出分子量約為1.96 ×104的重組GDF9蛋白質(圖2 左);在加入0.1 mmol IPTG 誘導4 h后蛋白質的表達量最高，達到總菌體蛋白質的30%左右(圖2 左)。在變性條件下經50% Ni-NTA 樹脂洗脫該蛋白質，再用Ni-NTA 凝膠純化分離，分離純化的純度達到95%以上(圖2 右)。

2.3 ELISA 法檢測血清抗體效價

圖3 顯示新西蘭兔在免疫GDF9 重組蛋白質之后的血清中抗GDF9 的抗體效價(由ELISA 分析的OD 值代表)。免疫前血清的抗體效價始終處于較低的非特異結合水平，免疫2 次后的效價有所上升，免疫3 次后的效價則進一步升高。第3 次免疫后血清抗體濃度稀釋至1∶ 51 200時，P/N 值仍然大于2(以P/N ＞2 判斷為陽性)，即說明抗體效價達到1∶ 51 200。

圖1 用Mega4.1 軟件獲得的15 個物種的進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of 15 species obtained by using Mega4.1 software

圖2 原核表達(左)和經Ni-NTA 凝膠純化(右)的GDF9 重組蛋白質(箭頭所示)電泳圖譜Fig.2 Protein electrophoresis (left)and Ni-NTA agarose gel purification (right)of recombinant GDF9 protein(arrows indicate)

2.4 抗GDF9 多克隆抗體的純化

抗血清經硫酸銨沉淀之后所分離的蛋白質再經Protein A Sepharose 特異性親和層析，洗脫收集的蛋白質在SDS-PAGE 電泳顯示較純的單一輕鏈和重鏈條帶(圖4)，圖像豐度計算顯示純化的抗體純度達到96%以上。用ELISA 法測定純化后抗體的效價，純化后1.2 mg/ml多克隆抗體按倍比稀釋，隨著抗體濃度越來越低，顯色越來越淺，稀釋至1∶ 6 400時P/N 值仍大于2(圖5)。

3 討論

本研究克隆獲得的水牛GDF9 成熟肽基因序列與黃牛的同源性最高，達到98%;與其他反芻動物也高度同源，如與山羊、中國麝香鹿和綿羊的同源性分別達到94.9%、94.7%和94.7%。利用15 個物種的序列所構建的系統進化樹說明該基因在哺乳動物尤其是反芻動物間功能比較保守，也與其他生長分化因子在不同物種之間高度保守相類似［14］。

圖3 抗血清中抗GDF9 抗體效價的ELISA 測定值Fig.3 ELISA determination of anti-GDF9 antibody titres in antiserum

圖4 純化的多克隆抗體的SDS-PAGE 結果Fig.4 SDS-PAGE result of purified polyclonal antibody

圖5 純化的多克隆抗GDF9 抗體效價的ELISA 檢測Fig.5 ELISA determination of anti-GDF9 antibody titres of purified polycolonal antibody

將水牛GDF9 基因插入表達質粒pRSET-A 的BamHⅠ和Hind Ⅲ兩酶切位點之間，表達1 個168 個氨基酸殘基組成的蛋白質，其中N 端36 個殘基包括6XHis 的組氨酸標簽源自pRSET-A 的序列，C 端的132 個殘基則源自GDF9。整個重組水牛GDF9 成熟肽融合蛋白質的理論分子量為19 162。經過多重PCR 擴增、酶切和連接等操作，獲得了閱讀框正確的表達供體pR-GDF9，并表達了分子量約為1.96×104的蛋白質，與理論值相符。同時，由于所表達的重組蛋白質可由Ni-NTA 凝膠結合并因此被純化，說明蛋白質分子中具有來源于表達載體pRSET-A 的6 個連續組氨酸標簽序列(His-Tag)。這些結果都說明分子克隆操作和所表達的重組蛋白質分子表達的正確性，為下一步工作和研究奠定了基礎。

同屬于TGFβ 超家族成員的GDF9 和BMP15(骨形態發生蛋白15)的羧基端具有很高的同源性［15-16］。在目前發現的一些高產羊品種中，很多是GDF9 和BMP15 基因突變造成發育的大卵泡提前成熟從而增加排卵數和提高了產仔數，而且GDF9和BMP15 基因突變在提高母羊排卵數方面有加性效應［3］。而在人為的免疫調控研究中，McNatty等［2］利用BMP15 和GDF9 作為抗原對僅產單羔的母羊進行免疫，發現在輕度免疫后使體內抗體效價不太高時，都能夠提高母羊的排卵率和產羔數。因此本研究所制備的抗原GDF9 可作為抗原用于免疫提高母羊排卵數和產羔數的新技術研發。此外，由于本研究所制備的GDF9 重組蛋白質包含成熟肽的完整序列，GDF9 與BMP15 成熟肽的羧基端具有很高的同源性［15-16］，因此免疫之后產生的抗體也可能與BMP15 結合，因而有可能最大限度地提高羊的排卵數。

除了對卵泡發育有重要的調控作用，GDF9 還具有影響卵子成熟和受精后胚胎發育的重要調控作用［6，10］。例如在小鼠卵子體外成熟培養液中添加GDF9，可以顯著增加受精后卵子發育至囊胚的比例［10］。推測GDF9 的這一作用是通過影響卵子周圍的放射冠細胞的功能而實現的。但動物繁殖中另一重要的過程，即卵子受精之后的胚胎的發育，是如何受到GDF9 的影響，目前還不清楚。由于一些生長分化因子，如卵泡抑素和與GDF9 相似的活化素，在卵子和胚胎之間表現出類似于對立統一的相反的調控作用［16-19］，因此GDF9 是否也類似于活化素而對發育的胚胎有負調控作用，這一問題目前并不明了，需要進一步研究。本研究所制備的高純度抗GDF9 抗體，可以應用于GDF9 調控胚胎發育的研究工作。

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