嵌合卵清蛋白-兔出血癥VP60 蛋白病毒樣顆粒在桿狀病毒表達系統(tǒng)中的表達及其鑒定

譚 暉， 胡 波， 陳萌萌， 范志宇， 魏后軍， 宋艷華， 王 芳

(1.江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所，農業(yè)部獸用生物制品工程技術重點實驗室，國家獸用生物制品工程技術研究中心，江蘇南京210014;2.南京農業(yè)大學動物醫(yī)學院，江蘇 南京210095)

兔病毒性出血癥(Rabbit hemorrhagic disease，RHD)是由兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起的一種高度接觸性傳染病［1］，該病毒為嵌杯病毒科兔病毒屬(Lagovirus)成員［2］。病毒粒子的衣殼由32 個5 ～6 nm 大小的殼粒構成，為一種分子量約6.0 ×104的主要結構蛋白質VP60 多重拷貝所組成［3-4］。研究證明，VP60衣殼蛋白質在沒有其他任何成分存在的條件下，在體外可自然聚合成不包裹核酸的、與天然RHDV 病毒粒子在物理形態(tài)上類似的病毒樣顆粒(VLPs)［5-6］。兔瘟病毒VLPs 具有很好的免疫原性，可以以胞吞或胞飲途徑進入抗原遞呈細胞分別誘導體液免疫應答和細胞免疫應答［7］。卵清蛋白質(OVA)第257 ～264 位氨基酸(SIINFEKL)為CD8 +T 細胞表位，這個位點受MHC-I 類分子限制，具有較強的免疫原性［8］，常用來誘導機體免疫應答。

法國學者Laurent 等［9］指出VP60 蛋白的C 末端組成了病毒的外表面(P 區(qū))，而N 末端構成了衣殼的內殼(S 區(qū))。江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所兔病與生物技術項目組(下文簡稱本實驗室)對不同來源的RHDV 毒株進行同源比對，發(fā)現(xiàn)RHDV 上存在一些高變區(qū)，這些高變區(qū)在不同RHDV 毒株中基因序列有所不同，我們又對這些高變區(qū)的二級結構進行預測，發(fā)現(xiàn)一些位點位于VP60 二級結構的連接區(qū)，不參與二級結構形成，為線性結構，如502 ～510 位、411 ～417 位、302 ～309 位氨基酸。本研究分別將VP60 以上3 個區(qū)域替換為外源OVA T-細胞表位，并在昆蟲細胞中表達，為研究嵌合VP60 蛋白的自聚能力及其免疫原性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 種毒(病毒)、質粒、細胞和菌種

供體質粒pFastBac1-VP60 由本實驗室構建并保存;大腸桿菌DH10 Bac 由本實驗室保存;Sf9 昆蟲細胞由本實驗室培養(yǎng);表達載體pFastBac1 購自Invitrogen 公司;pMD19-T Vector 購自TaKaRa 公司;大腸桿菌DH5α 感受態(tài)購買自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 主要試劑和儀器

DNA Marker DL2000 及DL15000 、限制性內切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ、T4 DNA Ligase、凝膠回收純化試劑盒等購自大連寶生物工程有限公司;PfxDNA 聚合酶、Taq 高保真酶、脂質體LipofectamineTM2000 和Grace 不完全培養(yǎng)液購自invitrogen 公司;胎牛血清購自購自GIBCO 公司;酶標兔抗小鼠IgG (FITCIgG)購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司;柱式動物RNAout 購自北京天恩澤基因科技有限公司;DAB 顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;小鼠抗VP60 單抗A3C 為本實驗室保存;人“O”型紅細胞取自南京軍區(qū)總醫(yī)院。柱式質粒DNAout試劑盒、柱式動物RNAout 購自北京天恩澤基因科技有限公司。病毒顆粒的電鏡觀察在東南大學醫(yī)學院大型儀器平臺的H-7650 型透射電鏡上操作完成。

1.3 引物設計

根據GenBank 數(shù)據庫RHDV 皖阜株VP60 基因序列(FJ794180)和卵清蛋白質(OVA)257 ～264aa的堿基序列，用Primer 5.0 軟件設計引物(由Invitrogen 公司合成)。上游引物VP60-F:5'-TTTGAATTCATGGAGGGCAAAGCCCGCAC-3'(EcoR I);下游引物 VP60-R:5'-GCCAAGCTTTCAGACATAAGAAAAGCC-3'(Hind Ⅲ)。第1 組引物:引物1(VP60-502-R ):5'-GGATCCGAGTTTTTCAAAGTTGATTATGGAGGATCCGTTGAGCGAAAGTCCAATTG-3';引物2(VP60-510-F):5'-GGATCCTCCATAATCAACTTTGAAAAACTCGGATCCCAGTTCTTCGTTTG GCAGTT-3'。第2 組引物:引物3(VP60-411-R):5'-GGATCCGAGTTTTTCAAAGTTGATTATGGAGGAT CCGCCGGTTACCACGGCATAAA-3';引物4(VP60-417-F):5'-GGATCCTCCATAATCAACTTTGAAAAAC TCGGATCCCTGTTTGTGATGGCCTCGGG-3'。第3 組引物:引物5(VP60-302-R):5'-GGATCCGAGTTTTT CAAAGTTGATTATGGAGGATCCACTGCCTCTTCGAT GGTCAA-3';引物6(VP60-309-F):5'-GGATCCTCCATAATCAACTTTGAAAAACTCGGATCCACCAACG TGCTTCAGTTTTG-3'。

1.4 重疊區(qū)擴增基因拼接法(SOE 法)構建目的基因

以SOE 法(圖1)構建第1 組重組基因片段為例，融合基因構建方法如下:首先利用引物VP60-F和引物1 擴增出片段1(片段1 為VP60 第1 ～502位氨基酸的堿基，末端引入OVA T 細胞表位堿基)。然后，利用引物2 和VP60-R 擴增片段2(片段2 為前端引入OVA T 細胞表位的堿基，后為VP60 第510 ～579 位氨基酸的堿基)。兩次PCR 的產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA 快速回收純化試劑盒回收凝膠中的目的片段，回收產物10 倍稀釋后作為第3 次PCR 的模板。第3 次PCR 反應體系(SOE反應):10 ×高保真PCR 緩沖液5.0 μl，2.5 mmol/L的dNTP 4.0 μl，PCR 1 和2 回收產物10 倍稀釋后各4.0 μl，Taq 高 保 真DNA 聚 合 酶0.2 μl，50 mmol/L MgSO42.0 μl。94 ℃預變性2 min;94 ℃變性30 s，37 ℃退火2 min，68 ℃延伸1 min，15 個循環(huán);68 ℃延伸5 min，結束反應。

圖1 重疊區(qū)擴增基因拼接(SOE)法示意圖Fig.1 Diagram of splicing by overlap extension (SOE)method

第3 次PCR 完成后，向體系中添加上游引物VP60-F 和下游引物VP60-R，進行第4 次PCR 反應。PCR 條件為:94 ℃預變性2 min;94 ℃變性30 s，53℃退火30 s，68 ℃延伸2 min，25 個循環(huán);68 ℃延伸5 min，結束反應。電泳得到第一組重組基因片段。外源OVA T 細胞表位取代VP60 蛋白上相應位點(圖2)。

圖2 OVA T 細胞表位置換VP60 氨基酸區(qū)域得到的3 組重組蛋白質示意圖Fig.2 Schematic diagram of the three recombinant proteins obtained by the OVA T cell epitopes replacing corresponding regions on VP60

PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下切下含目的條帶的瓊脂糖塊，用DNA 快速回收純化試劑盒回收凝膠中的目的片段，與pMD19-T 載體4 ℃過夜連接。連接后轉化大腸桿菌E.coli DH5 α感受態(tài)細胞，均勻涂布于事先37 ℃預熱的氨芐LB平板(100 μg/ml)上，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑單個菌落到5 ml 氨芐LB 中搖床過夜培養(yǎng)，柱式質粒DNAout試劑盒提取重組質粒。得到的質粒DNA 進行限制性內切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ雙酶切鑒定。酶切過后的溶液進行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切下含有目的條帶的凝膠，回收目的片段。

1.5 重組轉移載體的構建與鑒定

用T4 DNA 連接酶將含有粘性末端(位點為GAATTC，EcoR I 酶切位點;AAGCTT，Hind Ⅲ酶切位點)的pFastBac1 載體和回收的目的片段4 ℃連接12 h，轉化DH5α 感受態(tài)細胞。37 ℃溫箱過夜培養(yǎng)，挑單菌落搖床培養(yǎng)。用試劑盒提取質粒DNA 進行雙酶切鑒定，得到重組轉移載體pFast-V-1、pFast-V-2、pFast-V-3。將陽性克隆對應的菌液送Invitrogen 公司測序。測序正確的陽性質粒轉座新制備的DH10 Bac 大腸桿菌感受態(tài)細胞，經藍白斑篩選，獲得重組質粒Bacmid(Bacmid-V-1、Bacmid-V-2、Bacmid-V-3)。提取大片段質粒，以M13 上下游引物進行PCR 鑒定。PCR 循環(huán)條件為:95 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30 個循環(huán);72 ℃延伸10 min。反應結束后取10 μl 產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 重組穿梭質粒轉染Sf9 細胞

經PCR 鑒定為陽性的重組質粒，以脂質體LipofectamineTM2000 為共轉染試劑，轉染Sf9 單層細胞。轉染在24 孔板上進行，轉染后每12 h 觀察1次，直到細胞病變明顯時，收集細胞及上清液，得到3 種重組桿狀病毒rBac-v-1、rBac-v-2、rBac-v-3，以此作為重組桿狀病毒原液4 ℃保存。病毒原液按照1∶ 50 的比例感染Sf9 細胞，出現(xiàn)病變后，收集細胞和上清，此為第2 代病毒液。依此方法得到第7 代病毒液，此時病毒純度較高。

1.7 RT-PCR 鑒定重組病毒

收集第2 代感染重組病毒的Sf9 細胞，按照柱式動物RNAout 試劑盒說明書，提取桿狀病毒RNA，以目的基因上下游引物進行RT-PCR。RT 反應條件為:30 ℃反應10 min，42 ℃反應30 min，99 ℃反應5 min，5 ℃5 min。PCR 反應條件為:95 ℃預變性3 min;94 ℃變性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30 個循環(huán);72 ℃延伸10 min。反應結束后產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.8 表達產物的鑒定

1.8.1 間接免疫熒光檢測( IFA) 于24 孔細胞培養(yǎng)板上，將重組病毒接種對數(shù)生長期的Sf9 細胞，培養(yǎng)至發(fā)生病變時，以本實驗室制備的RHDV 單抗A3C 為一抗(1∶ 40)，采用間接免疫熒光法檢測嵌合蛋白質的表達。

1.8.2 蛋白質電泳(SDS-PAGE) 將重組桿狀病毒液以1∶ 100 的體積比感染Sf9 細胞。5 d 后輕輕吹下病變細胞，連同培養(yǎng)液一起分裝于1.5 ml 離心管中，3 000 r/min離心5 min 分離細胞和上清，棄上清。用PBS 重懸細胞，洗滌3 次，加入200 μl PBS，反復凍融3 次。加入5×上樣緩沖液，煮沸5 min，11 000 r/min離心2 min，取上清20 μl 進行蛋白質電泳。

1.8.3 免疫印跡( Western blot) 鑒定 采用半干轉印法。同方法1.8.2將樣品電泳后，取下凝膠，將其轉印于NC 膜上，2 mA/cm2轉印70 min。以RHDV單抗A3C 為一抗(1∶ 100)，羊抗兔IgG-HRP 為二抗(1∶ 2 000)，進行Western blot 鑒定。

1.9 電鏡觀察

取第7 代重組病毒2 ml 接入100 ml 密度為1 ml 2 ×106個的Sf9 細胞懸浮液，培養(yǎng)6 d。取30 ml 培養(yǎng)液，3 000 r/min離心5 min，棄培養(yǎng)液。沉淀用5 ml PBS 重懸，12 000 r/min離心5 min，棄上清。洗滌3 次后，用1 ml PBS 重懸沉淀。反復凍融3次，12 000 r/min離心5 min，取上清，用于電鏡觀察。

2 結果

2.1 重疊區(qū)擴增基因拼接法(SOE 法)獲得目的基因及其鑒定

以本實驗室保存的pFastBac1-VP60 為模板，利用primer5.0 設計退火溫度，用設計的各組引物，各進行4 次PCR，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得符合目標片段大小的條帶。目的基因與T 載體連接轉化后，進行雙酶切鑒定，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到與預期片段大小一致的特異條帶，成功構建3 組克隆質粒。

2.2 重組表達載體的酶切鑒定

T/A 鑒定后，目的片段與真核表達載體pFaster-Bac1 連接，轉化DH10 Bac 感受態(tài)細胞，提取質粒，進行雙酶切鑒定。1%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，得到與預期片段大小一致的特異條帶，同時測序結果表明成功構建嵌合VP60 重組質粒。

2.3 重組Bacmid 鑒定

用PCR 方法鑒定目的基因是否插入到Bacmid中。以pUC/M13 上游引物和下游引物對重組質粒的擴增產物大小約為3 000 bp，而以pUC/M13 上、下游引物對未插入外源基因片段的空Bacmid 質粒的擴增產物大小約為300 bp，證明轉座成功，重組桿狀病毒基因構建完成。

2.4 表達產物的鑒定

2.4.1 細胞病變 在脂質體LipofectamineTM2000介導下，將3 種重組質粒Bacmid-V-1、Bacmid-V-2、Bacmid-V-3 轉染Sf9 細胞。轉染5 d 后，對照細胞和轉染細胞顯示不同狀態(tài)。對照細胞生長基本沒有變化，細胞輪廓清晰，大小均一，胞體明亮;轉染后細胞則呈現(xiàn)明顯的細胞病變(CPE)，表現(xiàn)為:細胞直徑明顯增大，開始變圓、脫落，部分細胞裂解和死亡，說明轉染成功。

2.4.2 RT-PCR 鑒定重組病毒 按試劑盒說明書提取各組感染第2 代重組病毒的Sf9 細胞總RNA，以正常Sf9 細胞為對照。以目的基因上下游引物進行RT-PCR。目的條帶約為1 800 bp，與目的基因大小一致，而正常細胞無特異性條帶(圖3)。

2.4.3 蛋白質電泳(SDS-PAGE)及免疫印跡( Western blot) 檢測 電泳和轉印結果顯示:3 種重組桿狀病毒在昆蟲細胞中表達后均出現(xiàn)1 條分子量約為6.0 ×104的特異性條帶，與預期大小基本一致，說明目的蛋白質得到表達(圖4)。免疫印跡與電泳的目的條帶位置相符，說明3 種嵌合蛋白質均具有反應原性(圖4)。

圖3 RT-PCR 鑒定重組病毒mRNAFig.3 RT-PCR of the recombinant virus mRNA

圖4 3 種嵌合蛋白免疫印跡和SDS-PAGE 電泳結果Fig.4 Western blot and SDS-PAGE of three chimeric proteins

2.4.4 間接免疫熒光檢測 重組病毒感染Sf9 細胞24 h 后，以1∶ 40 倍稀釋的RHDV 單抗A3C 為一抗，1∶ 100 稀釋度的FITC 標記兔抗小鼠IgG 為二抗，進行間接免疫熒光檢測。結果(圖5)表明，感染重組病毒的Sf9 細胞和感染VP60 皖阜株的細胞具有很強的特異性熒光，而感染Bacmid 的對照和空白對照無特異性熒光，說明重組桿狀病毒在Sf9 細胞中表達。

2.5 嵌合蛋白病毒樣顆粒檢測結果

電鏡觀察結果(圖6)表明，VP60 蛋白不同位置被OVA 替換形成的3 組嵌合蛋白質都能形成與VP60 皖阜株病毒顆粒大小和形態(tài)類似的病毒樣顆粒(VLPs)。

3 討論

病毒樣顆粒(VLPs)作為新型疫苗既克服了傳統(tǒng)滅活疫苗免疫原性不高的缺點，也克服了活疫苗安全性的限制，同時具有不含有遺傳物質，可以大量制備，有良好的安全性和免疫原性等優(yōu)點［10-13］。兔出血癥病毒VLPs 展示載體的研究尚在起步階段，目前在N 末端、C 末端、306 ～307 位插入或替換外源B 細胞表位或T 細胞表位片段的研究較多。Barcena 等［14］、Nagesha 等［15］研究認為在C 端插入外源氨基酸不會改變VP60 形成VLPs 的能力。Crisci等［8］預測P2 亞單位突環(huán)處適合外源B 細胞表位(誘導特異性抗體)插入，并證明插入外源片段可形成VLPs 。P2 亞單位位于衣殼蛋白質表面，屬于免疫優(yōu)勢區(qū)域，包含VP60 第306 ～307 位氨基酸。本研究中的OVA T-細胞表位替換VP60 302 ～309 位氨基酸形成了病毒樣顆粒，表明此位點適合外源T細胞表位的替換，且外源片段替換后重組VP60 可形成VLPs。

圖5 間接免疫熒光檢測重組蛋白Fig.5 Indirect immunofluorescence assay of the recombinant proteins

圖6 3 組嵌合蛋白形成的病毒樣顆粒的電鏡圖Fig.6 Electron micrograph of virus-like particles formed by three chimeric proteins

嵌合型VLPs 是將外源蛋白質與不同來源的VLPs進行基因融合或化學結合，生成嵌合型VLPs［16］，從而誘導針對外源性蛋白質表位的免疫應答。本研究選擇了VP60 的3 個可變區(qū):502 ～510 位、411 ～417 位、302 ～309 位。此3 個位點的氨基酸分別用1 個OVA T細胞表位替換，經桿狀病毒表達系統(tǒng)表達得到3 個重組桿狀病毒。將病毒接種細胞培養(yǎng)一定時間，得到3組重組嵌合蛋白質Z1、Z2 和Z3。收獲處理后進行電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)3 組重組病毒表達的嵌合蛋白質Z1、Z2 和Z3 均可以形成VLPs，相同放大倍數(shù)的電鏡視野中Z3形成的VLPs 最多，Z2 形成的較多，Z1 形成的最少。我們認為此處的差異可能是由于接毒時各組毒價和/或病毒量不同造成的。重組顆粒大小約為50 nm，與VP60 皖阜株病毒顆粒的形態(tài)和大小類似，說明此3 個位點分別用1 個OVA T 細胞表位替換后，能形成嵌合型VLPs。我們同時發(fā)現(xiàn)，第3 組VLPs 密度最大，易尋找;第2 組除VLPs 外還可見少數(shù)比VP60 稍大、透光性比VP60 好、松散的不規(guī)則團狀物;第1 組VLPs 不易尋找，且存在很多類似團狀物。由于電鏡樣品在進行SDS-PAGE 和Western blot 時顯示的雜帶較少，由此推測不規(guī)則團狀物為未自聚成型的重組VP60 蛋白質，說明VP60 不同位點被替換，對病毒樣顆粒的自聚和組裝能力造成了不同程度的影響。由于302 ～309 位氨基酸位于VP60 P2 亞單位突環(huán)處，可能對插入的外源片段耐受性更高，對顆粒形成幾乎無影響，而502 ～510 位和411 ～417 位氨基酸的替換對VP60 顆粒形成有一定影響，因此302 ～309 位氨基酸位點可作為以VP60 VLPs為載體的嵌合疫苗中外源片段插入的潛在位點。

本研究中，免疫印跡結果表明3 種重組蛋白質對VP60 單抗具有反應原性，電鏡檢測結果說明能形成嵌合型VLPs，但是，VP60 中的外源OVA T-細胞表位能否引起動物機體的細胞免疫，以及此外源片段對VP60 引起動物機體免疫反應的影響等還需要進一步研究。

［1］ 蔡寶祥.家畜傳染病學［M］. 3 版. 北京:中國農業(yè)出版社，1998:299-301.

［2］ GREEN KY，CHANOCK R M，KAPIKAN A Z. Human calicivirus［M］ //Knipe D M，Howley P M. Fields virology. 4th ed.Philadelphia，Pa:Lippincott Williams ＆ Wilkins，2001:841-874.

［3］ WIRBLICH C，THIEL H J，MEYERS G. Genetic map of the calicivirus rabbit hemorrhagic disease virus as deduced from In vitro translation studies［J］. Journal of Virology，1996，70(11):7974-7983.

［4］ MARTIN-ALONSO J M，CASAIS R，BOGA J A，et al. Processing of rbabbit hemorrhagic disease virus polyprotein［J］. Journal of Virology，1996，70(2):1261-1265.

［5］ BARCENA J，MORALES M，VAZQUEZ B，et al. Horizontal transmissible protection against myxomatosis and rabbit hemorrhagic disease by using a recombinant myxoma virus ［J］. J Virol，2000，74 :1114-1123.

［6］ FARNOS O，BOUE O，PARRA F，et a1. High-level expression and immunogenic properties of the recombinant rabbit hemorrhagic disease virus VP60 capsid protein obtained in Pichia pastoris［J］.J Biotech，2005，117(3):215-224.

［7］ FARNOS O，BOUE O，PARRA F，et a1. High-level expression and immunogenic properties of the recombinant rabbit hemorrhagic disease virus VP60 capsid protein obtained in Pichia pastoris［J］.J Biotech，2005，117(3):215-224.

［8］ CRISCI E，ALMANZA H. Chimeric calicivirus-like particles elicit protective anti-viral cytotoxic responses without adjuvant［J］.Virology，2009，387 :303-312.

［9］ LAURENT S，KUT E，REMY-DELAUNAY S，et al. Folding of the rabbit hemorrhagic disease virus capsid protein and delineation of N-terminal domains dispensable for assembly［J］. Arch Virol，2002，147:1559-1571.

［10］ KEIM B. Controversy over cendcal cancer vaccine spurs safety surveil1ance［J］. Nat Med，2007，13(4):392-393.

［11］ VILLA L L，COSTA R L，PETTA C A，et a1. Prophylactic quadrivalent human papillomavirus (types 6，l1，16，and 18)L1 vireslike particle vaeeine in young women:a randomised double-blind placebo-controlled muhicentre phase II eficacy trial［J］. Lancet Oncol，2005，6(5):271-278.

［12］ 蓖 晨，孟繼鴻. 一種新型戊型肝炎病毒樣顆粒的表達、純化及其免疫原性［J］.細胞與分子免疫學雜志，2006，22(3):339-342.

［13］ HAMMONDS J，CHEN X，ZHANG X，et a1. Advances in methods for the production，purification and characterization of HIV-1 gag-envpseudovirion vaccines［J］. Vaccine，2007，25(47):8036-8048.

［14］ BARCENA J，VERDAGUER N，RAMóN R，et al.The coat protein of rabbit hemorrhagic disease virus contains a molecular switch at the N-terminal region facing the inner surface of the capsid［J］.Virology ，2004，322 (1):118-134.

［15］ NAGESHA H S，WANG L F，HYATT A D.Virus-like particles of calicivirus as epitope carriers［J］. Arch Virol，1999，144 (12):2429-2439.

［16］ RAMQVIST T，ANDRESESAN A，DALIANIS T.Vaccination，imnlune and gene therapy based on rims-like particles against viral infections and cancer［J］.Expert Opin Biol Ther，2007，7(7):997-1007.