雞IGFBP-3 基因C1087T 位點遺傳多態性及其對京海黃雞體重和產蛋性能的遺傳效應

俞亞波， 王金玉， 顧玉萍， 顧云飛， 金崇富

(1.江蘇京海禽業集團有限公司，江蘇 南通226103;2.揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州225009)

生長性狀和產蛋性能是雞的重要經濟性狀，是反映雞場生產力和經濟效益的重要指標。利用候選基因法進行分子標記輔助育種，是提高生長性狀和產蛋性能的基礎。生長激素-類胰島素-類胰島素結合蛋白質軸(GH-IGF-IGFBP 軸)通過調控細胞的增值和分化，影響動物機體的生長和生產性能的發揮［1-3］，GH、IGF 和IGFBP 基因是機體生長發育和生產性能發揮的重要候選基因。目前已經確定有7 種IGFBP 基因(IGFBP1 ～IGFBP7)，IGFBP-3 是其中重要的一種，它是血液中最豐富的IGFBP 結合形式［3-4］。血液中95% 的IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ都與IGFBP-3 結合［5-6］。IGFBP-3 有延長IGF 半衰期、調節IGF 的生物學活性等作用，故IGFBP-3 對IGF 功能的發揮有很大影響［7］，從而間接地影響家畜的生長發育、繁殖性能及肉的品質等［8-9］。近幾年來，隨著對家畜IGFBP-3 研究的不斷深入，發現IGFBP-3 基因多態性對家畜的產奶量、生長性能［10］、屠宰性能［11-13］以及繁殖性能［14］有顯著影響。

目前，畜禽IGFBP-3 基因多態性研究主要集中在牛和羊上［15-19］。雞IGFBP-3 基因的遺傳多態性研究鮮有報道［20］。本試驗把雞IGFBP-3 基因作為影響其體重和母雞產蛋性能的候選基因，利用PCRRFLP 技術對4 個雞品種MspI 酶切位點多態性進行檢測，并分析其對京海黃雞部分重要經濟性狀的影響，為將該基因用于京海黃雞的分子標記輔助育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗雞共326 只，其中200 只京海黃雞和30 只AA 雞取自江蘇京海禽業集團有限公司，46 只鹿苑雞取自中國農業科學院家禽研究所，50 只邊雞取自山西省農業科學院畜牧獸醫研究所。試驗雞翅靜脈采血，肝素鈉抗凝，按常規酚/氯仿抽提法提取基因組DNA。收集200 只京海黃雞的以下性狀:初生重、4 周齡體重、8 周齡體重、12 周齡體重、16 周齡體重、300 日齡體重、66 周齡體重、開產日齡、開產體重、開產蛋重、300 日齡產蛋數、300 日齡蛋重、66 周齡產蛋數和66 周齡蛋重。

1.2 PCR 引物的設計與合成

根據GenBank 上雞IGFBP-3 基因DNA 序列(基因登錄號:NC006089)，利用Primer 5.0 軟件設計1 對引物，用于擴增外顯子2 部分序列。上游引物為5'-CATCTTGGGACCAGTGCTTT-3'，下游引物為5'-ATTTTTCAAGCCTGCTGTGG-3'。擴增片段大小為161 bp。引物由上海生物技術服務有限公司合成，超純水溶解引物，-20 ℃保存備用。

1.3 基因型檢測

采用PCR-RFLP 方法對所有個體進行基因型檢測。PCR 擴增反應體系總體積為20.0 μl，其中DNA 1.0 μl，10 ×Buffer 2.0 μl，Mg2+(25 mmol/L)2.2 μl，上下游引物(10 pmol/μl)各1.0 μl，dNTPs(10 mmol/L)0.8 μl，Taq 酶(2 U/L)0.2 μl，ddH2O 11.8 μl。擴增反應條件為:94 ℃預變性5 min;94℃變性60 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個循環;72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。

取PCR 產物5.0 μl、限制性內切酶MspI 5 U和10 ×Buffer 1.0 μl，雙蒸水補足至10.0 μl，65 ℃水浴過夜，次日用10%的聚丙烯酰胺(Acr∶ Bis =29∶ 1)電泳檢測酶切產物。凝膠成像系統觀察酶切結果。根據特征條帶判定基因型。根據酶切結果，選取不同基因型個體的PCR 產物，經純化回收后，送至上海生物工程有限公司正反向直接測序。隨后對測定的序列進行比對分析，以驗證基因型判定的準確性。

1.4 統計分析

1.4.1 IGFBP-3 基因第2 外顯子多態性分析 采用SPSS 11.0 軟件計算基因頻率、基因型頻率、卡方(χ2)適合性、純合度(Ho)、雜合度(He)、有效等位基因數(Ne)和多態信息含量(PIC)等遺傳參數。

1.4.2 IGFBP-3 基因第2 外顯子多態性與京海黃雞體重和產蛋性能的關聯分析 運用SPSS 11.0 軟件，根據廣義線性模型分析IGFBP-3 基因型效應。建立模型如下:Yi=μ +Markeri+ei，其中Yi為性狀表型值，μ 為群體均值，Markeri為標記基因型效應，ei為隨機誤差。

2 結果與分析

2.1 IGFBP-3 基因第2 外顯子MspI 酶切多態性

IGFBP-3 基因第2 外顯子擴增序列的測序結果顯示所擴增的片段為目的片段。測序結果和PCRRFLP 檢測結果分別見圖1 和圖2。IGFBP-3 基因C1087T 位點的突變產生了MspI 酶切位點(C ↓CGG)多態性，經酶切消化后產生大小分別為161 bp、161 bp/95 bp/66 bp、95 bp/66 bp 的3 種帶型，分別命名為TT、CT、CC 基因型。

圖1 CC 和TT 基因型中IGFBP-3 基因序列比較Fig.1 Comparison of sequence of IGFBP-3 gene between CC genotype and TT genotype of chicken

圖2 IGFBP-3 基因第2 外顯子擴增產物MspⅠ酶切鑒定Fig.2 Identification of PCR products of IGFBP-3 gene exon 2 by MspⅠ

2.2 IGFBP-3 基因第2 外顯子C1087T 位點多態性遺傳分析

由表1 可知，京海黃雞、AA 雞、鹿苑雞、邊雞4個群體的IGFBP-3 基因C1087T 位點的基因型頻率分布趨勢一致:都是CC 基因型＞CT 基因型＞TT 基因型，4 個群體中優勢等位基因是C 基因，優勢基因型是CC 型。卡方適合性(χ2)檢驗結果表明:京海黃雞MspI 位點基因型分布偏離Hardy-Weinberg 平衡狀態(P ＜0.05)，其余3 個群體基因型分布處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(P ＞0.05)。

表1 4 雞種IGFBP-3 基因第2 外顯子C1087T 位點的基因頻率和基因型頻率Table 1 Frequencies of genotypes and alleles for locus C1087T of IGFBP-3 gene exon 2 in four chicken breeds

由表2 可知，4 個試驗群體中，AA 雞IGFBP-3基因第2 外顯子C1087T 位點純合度最大，為0.68;京海黃雞純合度最小，為0.53。4 個群體基因雜合度和多態信息含量變化趨勢相一致:京海黃雞＞鹿苑雞＞邊雞＞AA 雞。京海黃雞有效等位基因數最多，為1.90;AA 雞有效等位基因數最少，為1.47。

表2 IGFBP-3 基因第2 外顯子C1087T 位點遺傳多態性Table 2 Genetic polymorphism of locus C1087T for IGFBP-3 gene exon 2

2.3 IGFBP-3 基因第2 外顯子C1087T 位點多態性對京海黃雞生長性能的效應

IGFBP-3 基因第2 外顯子C1087T 位點多態性與京海黃雞生產性能相關分析結果見表3。C1087T位點多態性對京海黃雞初生重、4 周齡體重、8 周齡體重、12 周齡體重、16 周齡體重和開產體重均無顯著影響(P ＞0.05)。CT 基因型和TT 基因型300 日齡體重顯著高于CC 基因型(P ＜0.05)。京海黃雞C1087T 位點對不同周齡體重均顯示正的顯性效應，300 日齡時體重的加性效應和顯性效應值最大，分別為42.25 和55.60。

表3 IGFBP-3 基因第2 外顯子C1087T 位點多態性對京海黃雞生長的影響Table 3 Effect of polymorphism of locus C1087T for IGFBP-3 gene exon 2 on growth of Jinghai yellow chicken

2.4 IGFBP-3 基因第2 外顯子C1087T 位點多態性與京海黃雞產蛋性能的相關分析

京海黃雞IGFBP-3 基因第2 外顯子C1087T 位點基因型與產蛋性能的最小二乘均數、標準誤及該位點加性效應和顯性效應見表4。由表4 可知，C1087T 位點各基因型之間開產蛋重差異不顯著(P ＞0.05)。CC 基因型個體的開產日齡最大，為146.42 d;CT 基因型開產最早，為133.80 d。CC 基因型開產日齡顯著大于CT 基因型(P ＜0.05)。TT基因型300 日齡產蛋數和66 周齡產蛋數分別為111.94 個和186.80 個，TT 基因型300 日齡和66 周齡產蛋數顯著高于CC 基因型(P ＜0.05)。京海黃雞C1087T 位點對增加開產蛋重和開產日齡的加性效應為負值，分別為－0.03 和－4.20，對增加300日齡產蛋數和66 周齡產蛋數加性效應分別為2.06和3.31。

表4 IGFBP-3 基因第2 外顯子C1087T 位點多態性對京海黃雞產蛋性能的影響Table 4 Effect of polymorphism of locus C1087T for IGFBP-3 gene exon 2 on egg laying of Jinghai yellow chicken

3 討論

3.1 IGFBP-3 基因第2 外顯子C1087T 座位遺傳變異分析

本試驗通過對4 個雞品種IGFBP-3 基因第2 外顯子多態性的研究，首次發現IGFBP-3 基因第2 外顯子存在MspⅠ酶切多態位點。該座位C 基因頻率最高變化范圍為0.62 ～0.80，但在4 個雞種中的分布趨勢是一致的，其中AA 雞群體中C 和T 的基因頻率差異最大，分別為0.80 和0.20。

生物的遺傳變異，主要歸根于基因和基因型的差異。同一群體內個體之間的遺傳變異一般起因于等位基因的差異，而同一物種內不同群體之間的遺傳變異，則主要是由基因頻率的差異引起。平衡定律揭示了基因頻率與基因型頻率的遺傳規律，基因頻率的平衡對于群體穩定起著直接的保護作用［21］。在本研究中，鹿苑雞、邊雞和AA 雞IGFBP-3 基因第2 外顯子C1087T 位點基因型分布處于Hardy-Weinberg 平衡狀態，這說明這幾個雞品種在該座位處于隨機交配的穩定狀態。值得注意的是，處于Hardy-Weinberg 平衡狀態下的群體，AA 雞CC 基因型頻率為0.67，鹿苑雞的CC 基因型頻率只有0.48，說明隨機交配下的群體經常維持不同基因頻率下的平衡。京海黃雞IGFBP-3 基因第2 外顯子MspI 酶切位點基因型分布不符合Hardy-Weinberg 平衡，可能是受到人工選擇的影響，因為京海黃雞是經過多個世代連續人工選育而成的優質雞品種，在選育過程中打破了該基因座的平衡，進行有效的選種和選配，從而導致MspI 位點基因型的分布不符合Hardy-Weinberg 平衡。

當多態信息含量處于中度多態(0.5 ＞PIC ＞0.25)水平時，4 個雞種C1087T 位點均屬于中度多態位點。但4 個雞種中京海黃雞的PIC 最高(0.36)，等位基因數目最多(1.90)，雜合度也最大(0.47)，表明京海黃雞在該位點有較大的選擇潛力。

3.2 IGFBP-3 第2 外顯子MspI 位點與京海黃雞生長和繁殖性能的相關性

本試驗通過IGFBP-3 基因多態性與京海黃雞300 日齡體重和母雞產蛋性能的相關研究發現，C1087T 突變與京海黃雞產蛋性能顯著相關，這與IGFBP-3 的生理功能密不可分。一方面，大量的研究證實，IGFBP-3 通過GH-IGF-IGFBP 軸有促進細胞生長和增值的重要作用［22-24］。IGFBP-3 通過依賴性和非依賴性2 種作用方式結合IGF，影響胰島素樣生長因子受體下游信號轉導通路中的信號強度，從而調控靶細胞的生長和增值，影響畜禽生長和繁殖性能的發揮［2］。另一方面，IGFBP-3 基因的多態性對畜禽的經濟性狀也有著一定的影響。例如張潤鋒等發現IGFBP-3 基因HaeⅢ位點多態性對奶牛產奶量、乳蛋白率和體細胞評分有顯著影響［25］。Gao等發現中國肉牛IGFBP-3 第2 外顯子有1 個T/C突變與牛胸圍和臀圍有顯著關系:BB 型個體的臀寬和胸圍顯著高于AB 型個體［15］。Lan 等首次在山羊IGFBP-3 基因中發現HaeⅢ和XspⅠ位點多態性，進一步研究發現山羊IGFBP-3 基因CC 基因型平均每胎產羔數顯著高于CG(CT)型個體［16，26］。這都說明基因多態性與家畜的生產性能相關聯。家禽中的相關研究結果也顯示，IGFBP-3 基因內含子1 的第160 bp 處T→G 的突變與京海黃雞8 周齡體重和產蛋數相關［20］。這些都表明IGFBP-3 基因是與畜禽生產性能相關的重要候選基因，對其進行分子標記輔助選擇能有效地提高畜禽的生產性能。

從研究的結果還可以看出TT 基因型是增加產蛋數的優勢基因型，而產蛋數與種雞的經濟效益存在直接的關系，因此，可以將TT 基因型作為產蛋性狀的優勢基因型用于京海黃雞的標記輔助選擇育種。

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