鵝圓環(huán)病毒競爭PCR 檢測方法的建立

林 蕾， 袁海霞， 田 敬， 郭 婧， 劉曉寧， 孫紅霞， 余旭平

(1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部動物疫病病原學(xué)與免疫控制重點實驗室，浙江 杭州310058;2.湖北工業(yè)大學(xué)輕工學(xué)部，湖北 武漢430068;3.浙江省象山縣畜牧獸醫(yī)總站，浙江 寧波315700)

鵝圓環(huán)病毒(GoCV)是近年來發(fā)現(xiàn)的圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus)的一個新成員。與其他圓環(huán)病毒相似，鵝圓環(huán)病毒常潛伏感染，往往侵染淋巴細胞等增殖速度快的細胞，引起免疫力下降，導(dǎo)致動物繼發(fā)感染其他病原，從而給養(yǎng)鵝業(yè)帶來重大經(jīng)濟損失［1］。鵝圓環(huán)病毒首次于1999 年由德國學(xué)者Soike 等［2］從患病鵝病理組織中發(fā)現(xiàn)，隨后中國臺灣(2003 年)、匈牙利(2004 年)等地［3-5］相繼有報道。2005 年余旭平等在中國內(nèi)地首次從浙江永康禽流感病死鵝樣品中采用PCR 方法檢測到GoCV［6］，并檢測了浙江省不同地區(qū)9 個鵝場的GoCV 感染情況，克隆測定了10 株GoCV 全基因組序列，初步分析了GoCV 的分子流行病情況［7］。

迄今為止，GoCV 尚不能進行體外細胞培養(yǎng)，難以獲得單一病毒株，這給GoCV 的檢測和防治帶來了難度。英國學(xué)者Scott 等嘗試建立了間接免疫熒光方法［8］，本實驗室也進行了GoCV 外殼蛋白的表達［9］，并應(yīng)用表達抗原建立了ELISA 方法［10］。但目前，GoCV 的檢測主要采用PCR 方法，然而常規(guī)PCR不能對組織病料中的病毒進行定量。實時熒光定量PCR 將PCR 與熒光檢測相結(jié)合，可以對待檢樣品中的病毒進行準確的定性和定量。本實驗室田敬等于2010 年建立了檢測GoCV 的實時熒光定量PCR(Real-time PCR)方法［11］，但需要專門的檢測設(shè)備、相應(yīng)檢測試劑價格昂貴等，一定程度上限制了其應(yīng)用的廣泛性，特別是基層。而競爭PCR 方法［12］是通過構(gòu)建含有目的基因的目標模板和缺失部分序列的競爭模板，采用同一對引物擴增兩種大小有一定差異的DNA 片段，通過二者擴增拷貝數(shù)比值與初始時加入相應(yīng)目的模板的分子數(shù)間的相關(guān)，構(gòu)建標準競爭曲線，獲得直線回歸方程，進而推算出目的基因在樣品模板中的含量。與實時熒光定量PCR 相比，競爭PCR 方法經(jīng)濟、方便且不需要高端設(shè)備，凡是能進行常規(guī)PCR 的實驗室基本上都能夠?qū)Π谢蚱芜M行定量。本試驗擬構(gòu)建用于競爭PCR 的兩種模板，建立鵝圓環(huán)病毒DNA 快速定量的競爭PCR檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

含有菌株GoCV-yk01 全長基因組的重組質(zhì)粒pMDT-GoCV-yk01，由本實驗室構(gòu)建并保存;鵝法氏囊組織采自象山某GoCV 陽性鵝場。

1.2 主要試劑

pGEM-T Easy Vector 克隆載體購自Promega 公司，pMD18-T Vector 克隆載體以及rTaq DNA 聚合酶、dNTP Mix 和各種限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa 公司;T4 DNA 連接酶購自New England Biolabs 公司;DNA marker (DL2000)購自東盛公司;A 型超純質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購自博大泰克;凝膠回收試劑盒購自Axygen 公司。

1.3 目標模板pGoCV625-T 的構(gòu)建

應(yīng)用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計1 對引物(g3-up:5'-TTCCTGAGTCTGCGAAAGAATG-3';g3-dn:5'-TACAATGCCGACACATCACACT-3')，以重組質(zhì)粒pMDT-GoCV-yk01 為模板，通過PCR 擴增出目標片段，純化后與pGEM-T Easy Vector 連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1 感受態(tài)細胞，篩選獲得的質(zhì)粒命名為pGoCV625-T(簡稱為625-T 質(zhì)粒)。

1.4 競爭模板pGoCV300-T 的構(gòu)建

將方法1.3 中獲得的目標片段用Sau3A I 酶消化，純化后自連，以自連產(chǎn)物為模板進行PCR 擴增，割膠回收大小約300 bp 的片段，純化后與pMD18-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1 感受態(tài)細胞，篩選獲得1 個插入片段大小為300 bp 的質(zhì)粒，并命名為pGoCV300-T(簡稱為300-T 質(zhì)粒)。

1.5 競爭PCR 方法的建立

1.5.1 特異性鑒定 檢測PCR 產(chǎn)物與目的片段大小是否一致。

1.5.2 敏感性試驗 核酸蛋白儀測定625-T 質(zhì)粒與300-T 質(zhì)粒濃度，稀釋至1.0 μl 分別含1.0 ×106、1.0 ×105、1.0 ×104、1.0 ×103、1.0 ×102拷貝，在反應(yīng)體系中分別加入1.0 μl 625-T 質(zhì)?；?00-T 質(zhì)粒單一模板，進行PCR 擴增，測定建立的PCR 方法能檢測到相應(yīng)模板的最低拷貝數(shù)。然后，以1.0 μl 含有1.0 ×108、1.0 × 107、1.0 × 106、1.0 × 105、1.0 ×104、1.0 ×103、1.0 ×102同等拷貝數(shù)的625-T 質(zhì)粒和300-T 質(zhì)粒的混合物為模板，進行PCR 共擴增，檢測在2 種模板同時存在下的擴增極限和效率。

1.5.3 標準曲線的制作 用固定體積(1.0 μl)的300-T 質(zhì)粒(1.0 μl 1.0 ×105拷貝)與系列倍比稀釋的625-T 質(zhì)粒(起始量為1.0 μl 含1.0 ×107拷貝，經(jīng)2-2至2-12倍比稀釋，反應(yīng)體系中加入1.0 μl)混合模板進行PCR 擴增，電泳結(jié)果用BandScan 軟件分析，獲得競爭模板(300-T 質(zhì)粒)與目標模板(625-T 質(zhì)粒)PCR 產(chǎn)物的熒光強度(IOD)。以競爭模板與目標模板的IOD 比值的對數(shù)值為縱坐標(Y 值)，以目標模板濃度的對數(shù)值為橫坐標(X 值)，制作標準曲線，建立回歸方程。

1.5.4 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗 對定量競爭模板(300-T 質(zhì)粒)與系列倍比稀釋的目標模板(625-T 質(zhì)粒)進行競爭PCR 擴增，重復(fù)3 次，驗證試驗的可重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.6 競爭PCR 方法的初步應(yīng)用

用實驗室自行設(shè)計的2 對特異性檢測引物(gup:5'-CACTATTAATAACCCTACCTTTG-3'， g-dn:5'-ATAGCCRTCCCACCACTTCCC-3'，R = A/G，擴增片段長度為552 bp;g3-up 和g3-dn 見方法1.3，擴增片段長度為625 bp)對待檢法氏囊樣品進行常規(guī)PCR 檢測，對結(jié)果呈陽性的樣品進行競爭PCR 檢測，以確定樣品中的病毒含量。

2 結(jié)果

2.1 目標模板的鑒定

對構(gòu)建的目標模板質(zhì)粒pGoCV625-T 同時采用PCR 和質(zhì)粒酶切鑒定，以目標質(zhì)粒為模板可以擴增出大小為625 bp 的片段(圖1-A);質(zhì)粒pGoCV625-T 經(jīng)EcoR I 和Hind Ⅲ酶切可以切出2 個片段，大小分別為625 bp (目標模板)和3 000 bp(載體)(圖1-B)。

圖1 重組質(zhì)粒pGoCV625-T 的PCR(A)和酶切鑒定(B)Fig.1 Identification of pGoCV625-T recombinant plasmid by PCR(A)and restrition enzymes(B)

2.2 競爭模板的鑒定

構(gòu)建的競爭模板pGoCV300-T 中插入的片段較短，因此僅采用PCR 擴增方法進行鑒定。由圖2 可見，PCR 擴增產(chǎn)物的大小約為300 bp。

圖2 重組質(zhì)粒pGoCV300-T 的PCR 鑒定Fig.2 Identification of pGoCV300-T recombinant plasmid by PCR

2.3 單一模板與雙模板共擴增檢測限量的測定

分別以625-T 質(zhì)粒和300-T 質(zhì)粒為模板，進行PCR 擴增，檢測到單模板擴增的最低限量均為1.0 μl 1.0×104拷貝。用625-T 質(zhì)粒與300-T 質(zhì)粒同等體積(1.0 μl)混合的雙模板進行PCR 共擴增，結(jié)果見圖3?？梢钥闯觯嗤瑵舛鹊?25-T 模板與300-T 模板能有效地共擴增，且一組中兩種擴增條帶亮度基本相同，說明其共擴增效率基本相當，競爭模板與目標模板共擴增的檢測最低限量為1.0 μl 1.0×104拷貝。

圖3 共擴增檢測極限的確定Fig.3 Detection limit of pGoCV625-T and pGoCV300-T recombinant plasmids by PCR co-amplification

2.4 競爭PCR 檢測體系的構(gòu)建

用固定體積(1.0 μl)量的300-T 質(zhì)粒(1.0 μl含1.0 × 105拷貝)分別與625-T 質(zhì)粒(1.0 μl 含1.0 ×107拷貝)2-2至2-12倍比稀釋液混合，以此混合物為模板進行PCR 擴增，觀察2 種模板的競爭關(guān)系，結(jié)果見圖4。競爭PCR 電泳結(jié)果經(jīng)凝膠成像儀拍照并經(jīng)BandScan 軟件分析，獲得競爭模板(300-T質(zhì)粒)與目標模板(625-T 質(zhì)粒)PCR 產(chǎn)物的熒光強度(IOD)。

圖4 不同比例的目標模板和競爭模板的競爭PCR 結(jié)果Fig.4 The cPCR of mixed templates with different proportions of target and competitor

2.5 重復(fù)性和穩(wěn)定性

上述競爭PCR 擴增的3 次重復(fù)試驗數(shù)據(jù)基本一致，說明試驗具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.6 標準曲線的制作

競爭PCR 電泳結(jié)果經(jīng)凝膠成像儀拍照并經(jīng)BandScan 軟件分析，獲得競爭模板(300-T 質(zhì)粒)與目標模板(625-T 質(zhì)粒)PCR 產(chǎn)物的熒光強度(IOD)。以競爭模板與目標模板的IOD 比值的對數(shù)值作為縱坐標(Y)，以目標模板濃度的對數(shù)值為橫坐標(x)，制作標準曲線，建立回歸方程為Y =－0.831 2x+4.272 2(R2=0.992 8)。當Y =0 時，表明兩擴增產(chǎn)物相等，即625-T 質(zhì)粒與300-T 質(zhì)粒的PCR 產(chǎn)物量相等，通過計算得出當初加入的標準模板625-T 質(zhì)粒為1.0 μl 1.4 ×105拷貝，而反應(yīng)體系中競爭模板300-T 質(zhì)粒的加入量為1.0 μl 1.0 ×105拷貝，由此可見標準模板與競爭模板的總體擴增效率非常接近。

2.7 樣品定量檢測

對待測的鵝法氏囊組織，首先采用常規(guī)PCR 方法檢測GoCV，在GoCV 呈陽性的法氏囊樣品中，取5 份進行病毒定量檢測，將每份研磨并混勻的法氏囊組織稱重，提取DNA 溶于100 μl DEPC 水中，取其中1.0 μl 進行競爭定量PCR 檢測，根據(jù)標準曲線及回歸方程計算起始模板濃度，再計算出鵝法氏囊組織中的病毒拷貝數(shù)。測定結(jié)果(表1)顯示陽性法氏囊組織中GoCV 病毒含量在105～106數(shù)量級，與作者之前采用實時熒光定量PCR 檢測的結(jié)果相當［10］。

表1 法氏囊中鵝圓環(huán)病毒的定量檢測Table 1 Quantitative detection of GoCV in bursa

3 討論

本研究建立了定量檢測鵝圓環(huán)病毒DNA 的競爭PCR 方法。首先構(gòu)建了用于競爭PCR 的pGoCV625-T 目標模板和pGoCV300-T 競爭模板，檢測了兩者共擴增的檢測極限為1.0 ×104拷貝，繼而應(yīng)用300-T 競爭模板(1.0 μl 含1.0 ×105拷貝)與不同稀釋度625-T 目標模板(1.0 μl 含1.0 ×107拷貝，然后經(jīng)2－2至2－12共11 個梯度的倍比稀釋)混合進行競爭PCR 擴增，以二者PCR 產(chǎn)物的熒光強度(IOD)比值與目標模板濃度的對數(shù)值間的關(guān)聯(lián)性建立了標準競爭曲線及直線回歸方程。進一步應(yīng)用此方法對部分GoCV 陽性鵝的法氏囊組織中的病毒量進行定量檢測，結(jié)果與之前采用實時熒光定量PCR檢測的結(jié)果相當［10］。

由建立的競爭PCR 標準曲線及回歸方程計算得出，本試驗中標準模板與競爭模板的總體擴增效率基本相當。理論上，PCR 擴增均呈2n指數(shù)增長，但實際上，可能由于反應(yīng)體系和反應(yīng)條件等多種因素，PCR 擴增效率通常達不到理論值。在多模板存在的情況下，PCR 相對更容易擴增短的模板，因此短模板的產(chǎn)物量就大，長模板的產(chǎn)物量則少，甚至沒有。同樣，在本試驗建立的競爭PCR 體系中，短的競爭模板300-T 質(zhì)粒的擴增效率略高，而標準模板625-T 質(zhì)粒的擴增效率略低，但總體上二者相差不大，由此推測本試驗建立的競爭PCR 體系和條件具有更穩(wěn)定的競爭擴增效果。

崔尚金等［13］采用競爭PCR 方法檢測了臨床樣品中豬圓環(huán)病毒2 型(PCV2)DNA 含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCV2 DNA 含量在肺中達到1.0 ml 1.0 ×108拷貝、血中1.0 ml 0.8 ×107拷貝、淋巴中1.0 ml 9.7 ×108拷貝以上時，豬表現(xiàn)出臨床癥狀，而從亞臨床感染或健康狀態(tài)的豬采集的樣品中PCV2 含量均低于此值。劉澤文等［14］用競爭PCR 定量法最低能夠檢測雞傳染性貧血病毒DNA 1.0 μl 1.0 ×103.5拷貝。田敬等［11］建立的實時熒光定量PCR 方法，GoCV 最低檢測限為1.0 μl 1.46 ×102拷貝。本研究建立的競爭PCR 法檢測GoCV，最低檢測限為1.0 μl 1.0 ×104拷貝。相比而言，田敬等［11］建立的方法靈敏度更高，但本方法具有經(jīng)濟、方便、操作簡單等優(yōu)點，更適合擁有常規(guī)PCR 儀的基層單位開展GoCV 檢測和定量。

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