初診2型糖尿病患者血清中miR－29a和miR－375表達變化及其與糖、脂標志物相關性研究

梁國威，宋 燕，邵冬華，徐 旭，何美琳

（航天中心醫院 檢驗科，北京 100049）

MicroRNA（miRNA）是一組由19－24個核苷酸組成，含有莖環結構，非編碼蛋白質的小分子RNA，其主要通過與靶mRNA的3’端非編碼區完全或不完全的堿基互補結合，在蛋白質翻譯水平上進行調控［1－2］。目前，大量的研究顯示 miRNA在心血管、感染、腫瘤以及糖尿病等疾病過程中呈現特異性的表達并起到重要作用［3－4］。

目前，在2型糖尿病（DM）患者循環血液中miRNA的變化情況已有文獻報道。Zampetaki A等［5］通過基因芯片掃描和熒光定量PCR檢測確證，在DM患者血循環中有13個miRNA表達異常，其中 miR－15a、miR－29b、miR－126、miR－223表達下調和miR－28－3p表達上調在2型糖尿病早期即可發生。Kong L等［6］通過文獻檢索選擇7個miRNA，并進一步檢測了它們在DM前期和新發DM患者血清中的表達水平，結果顯示，miR－9、miR－29a、miR－34a、miR－146a、miR－375在新發DM患者中表達皆顯著高于健康對照和糖尿病前期組。但在DM患者中，疾病相關miRNA表達變化和糖、脂標志物的相關性研究國內外未見研究報道。本研究經文獻檢索選擇miR－375和miR－29a作為標志物，通過檢測其血清中表達情況，探討上述2個標志在初診DM患者中表達差異，及其變化與糖、脂標志物的相關性。

1 材料與方法

1.1 研究對象及分組 收集2011年12月－2012年3月我院資料完整的健康體檢者者，并根據體檢者自述排除既往已確診的DM的體檢者，按1999年WHO的DM診斷標準，所有研究對象均行75克葡萄糖（OGTT）實驗，根據空腹血糖（FPG）和2 h血糖（2 hPG）將研究對象分為糖代謝正常組和DM組。具體標準為：健康對照組：FPG＜6.1 mmol／L和2 h PG＜7.8 mmol／L；DM 組：FPG ≧ 7.0 mmol／L和／或2hPG ≧11.1 mmol／L。通過篩查共分為2組，2型糖尿病患者組（DM組）：48例，男27例，女21例，年齡35－72歲（平均54.9±9.8歲）；健康對照組：38例，男22例，女16例，年齡40－72歲（平均55.0±9.3歲）。

1.2 常規指標檢測 （1）臨床基本資料調查：由專人調查體檢人員的身高、體重，并計算體重指數（BMI）；血壓測量方法為休息15min后坐位測量右上臂肱動脈收縮壓（SBP）和舒張壓（DBP），取3次測量平均值。（2）實驗室檢查：空腹10 h后，使用真空采血管（美國BD公司提供）抽取空腹及服糖后2 h肘靜脈血，血液離體2 h內檢測完畢。采用全自動生化分析儀（AU2700，Olympus，日本）測定甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL－C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL－C）、FPG 和2h PG，試劑由日本OLYMPUS公司配套提供。糖化血紅蛋白（Hb A1c）采用高效液相色譜法（HLC－73G7，Tosoh，日本）測定。

1.3 血清miRNA提取 采用mir Vana PARIS RNA試劑盒（編號AM1556，ABI公司，美國），取6 h內空腹新鮮血清400μl，嚴格按照試劑盒說明操作，提取100μl總RNA，RNA提取后立即－80℃保存。

1.4 miRNA相對定量檢測 （1）逆轉錄：采用Taqman microRNA逆轉錄試劑盒（編號4366596，ABI公司，美國），在Gene Amp 9700 PCR儀（ABI公司，美國）上進行逆轉錄。反應體系15μl，包括：提取總 RNA按1∶1稀釋后取5μl，100 m M d NTPs 0.15μl，MultiScribe Reverse Transcriptase 1μl，10×Reverse Transcription Buffer 1.5μl，RNase Inhibitor 0.19μl，水4.16μl，逆轉錄引物3 μl。反應條件為：16℃30 min，42℃30 min，85℃5 min，4℃ ∞，逆轉錄產物（c DNA）立即進行實時熒光定量PCR檢測。（2）實時熒光定量PCR檢測：采用7500 Real Time PCR System（ABI公司，美國），每個cDNA樣本同時檢測3次，循環閾值（Ct值）取3次平均值。反應體系20μl，包括：cDNA按1∶1稀釋后取5μl，Taq Man Universal Master Mix II（ABI公司，美國）10μl，水4μl，引物及探針1μl。循環條件為：95℃10 min；95℃15 s，60℃1 min，40個循環。逆轉錄和熒光實時定量PCR檢測所用引物和探針由美國ABI公司提供，編號分別是：RNU6B：001093；hsa－miR－375：000564；hsa－miR－29a：002112。

1.5 統計學處理 由于RNU6B（非編碼小RNA）作為內參基因被廣泛應用于miRNA研究之中［6］，本研究選擇RNU6B作為內參基因。miR－29a和miR－375相對表達量以 △Ct表示，△Ct為目的基因Ct值與RNU6B Ct值的差值。采用SPSS10.0統計軟件，計量資料采用±s表示，其中不符合正態分布者以中位數（25%，75%）表示，并取自然對數后進行組間比較。計量資料組間比較采用獨立樣本T檢驗，計數資料采用卡方檢驗。相關性檢驗采用Pearson相關分析。以P＜0.05做為差別有顯著性的標準。

2 結果

2.1 研究對象的基本資料

DM組和對照組的FPG分別為5.1±0.5 mmol／L和8.8±1.55.1 mmol／L、2hPG 分別是6.7±0.5 mmol／L和15.4±4.3 mmol／L，Hb A1c是5.6±0.3%和8.4±1.5%，DM 組均顯著高于對照組（P＜0.001）。與對照組比較，DM 組的BMI、SBP、DBP、TG、HDL－C 顯 著 高 于 對 照 組 （P＜0.05）。對照組和DM 組間的性別、年齡、TC、LDLC無顯著性差異（P＞0.05）。

表1 研究對象的基本資料

2.2 外周血中 miR－29a、miR－375的ΔCt值變化情況

miR－29a在對照組和DM組血清中ΔCt值分別是－9.15±1.29和10.2±1.45，DM 組血清中miR－29a表達量顯著高于對照組（P＝0.001）；miR－375在對照組和DM組血清中ΔCt值分別是－5.76±1.1.67和－7.18±1.93，DM 組中的 miR－375表達量顯著高于對照組（P＝0.001）。

用對照組和DM組外周血中的△Ct平均值計算差值（△△Ct值），miR－29a的△△Ct值為1.05，計算2△△ct＝2.07，即DM患者外周血中miR－29a表達量約為正常人的2.07倍，同理，miR－375的△△Ct值為1.42，DM患者外周血中miR－375表達量約為正常人的2.68倍。

2.3 血清中 miR－29a、miR－375的 ΔCt值與糖、脂檢測指標相關性分析

所有研究對象（n＝86例）中的相關分析顯示，miR－29a的ΔCt值與TG、TC、HDL－C、LDL－C皆無顯著相關性（P＞0.05），與FPG（r＝－0.422，P＜0.001）、2hPG（r＝－0.417，P＜0.001）和 Hb A1c（r＝－0.548，P＜0.001）顯著負相關，顯示隨FPG、2hPG和Hb A1c升高血清中miR－29a的表達量顯著增加；miR－375的 ΔCt值與 TG、TC、HDL－C、LDL－C也皆無顯著相關性（P＞0.05），與FPG（r＝－0.400，P＜0.001）、2hPG（r＝ －0.464，P＜0.001）和 Hb A1c（r＝－0.588，P＜0.001）也顯著負相關，顯示隨FPG、2h PG和 Hb A1c升高血清中miR－375的表達量也顯著增加。見表2。

表2 miR－29a、miR－375的ΔCt值與糖、脂檢測指標相關性分析

2.4 miR－29a和miR－375的ΔCt值相關性分析

所有研究對象（n＝86例）中的相關分析顯示，miR－29a和 miR－375的 ΔCt值的相關系數r＝0.828，P＜0.001，顯示 miR－29a和 miR－375在 DM患者血清中表達量具有顯著正相關性。

3 討論

胰島素抵抗和胰島β細胞功能障礙是2型糖尿病發病的兩大機制。本研究選擇在初診2型糖尿病患者血清中檢測miR－29a和miR－375，是由于大量基礎研究皆顯示miR－29a和miR－375與胰島β細胞分化、胰島素表達和分泌，以及血糖水平變化和胰島素抵抗等2型糖尿病的發生、發展的關鍵因素具有顯著關系。

研究顯示，miR－29a在血糖刺激的胰島素分泌和胰島素抵抗中起重要作用。He A［7］等人的研究標明，在糖尿病小鼠的骨骼肌、脂肪組織和肝臟中miR－29a表達明顯上調。相反，在3T3－L1脂肪細胞中通過高表達miR－29a可顯著抑制胰島素刺激的血糖吸收，導致胰島素抵抗的發生。最新研究顯示，血糖水平變化可顯著上調人和鼠的胰島β細胞中miR－29a表達，而miR－29a表達上調可顯著降低血糖刺激的胰島素分泌。由于下調miR－29a表達可顯著提高胰島β細胞的分泌功能，提示miR－29a表達上調在糖代謝紊亂至糖尿病的發展過程起重要作用［8］。

miR－375在胰島β細胞分化和胰島素分泌中起重要作用。在miR－375基因敲除的小鼠模型中［9］，胰島β細胞分化受損而減少，出現高血糖癥，胰腺α細胞生成增加，糖異生和肝糖輸出增加，提示miR－375在維持血糖穩態、胰島α和β細胞生長，以及由胰島素抵抗所致胰島β細胞分化方面具有中重要作用。進一步研究標明［10］，在胰島β細胞中高表達的miR－375可能通過作用于肌侵蛋白（Myotrophin）抑制血糖誘導的胰島素分泌。相反，抑制miR－375表達可加強胰島素分泌，顯示miR－375對胰島素的分泌有負性調節作用。而El Ouaamari A等［11］研究顯示，miR－375可直接抑制3′－磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）的翻譯，降低血糖刺激的胰島素基因表達和合成，高血糖則可升高PDK1蛋白表達并同時降低miR－375表達。

盡管在組織和器官中 miR－29a和miR－375與糖代謝相關因素關系的研究已有大量文獻報道，由于認識上的局限性，2008年才首次發表了血清中存在大量的 miRNA［12－13］。目前，血清中 miR－29a和miR－375表達變化與糖尿病的相互關系研究報道較少。Kong L等［6］在血清中的研究顯示，與健康對照組和糖尿病前期組比較，在新診斷的2型糖尿病患者血清中 miR－29a和 miR－375表達皆顯著上調。我們的研究除證實2型糖尿病患者血清中miR－29a和 miR－375皆表達上調外，miR－29a和 miR－375表達量的變化與空腹血糖、OGTT 2h血糖和Hb A1c具有顯著的正相關性，提示miR－29a和miR－375在血清中表達變化有可能作為診斷2型糖尿病的分子標志物，或從治療的角度作為2型糖尿病患者治療新的分子靶點。

盡管有基礎研究顯示，miR－375可在脂肪細胞分化過程中起重要作用［14］。本研究顯示，血清中miR－375表達量的變化與 TG、TC、HDL－C、LDL－C皆無顯著相關性。盡管有文獻報道高血糖可刺激脂肪細胞中 miR－29a的高表達［15］，但 miR－29a與脂肪細胞分化、脂肪代謝的相關性未見文獻報道。本研究也證實血清miR－29a表達量與血脂各指標無顯著相關性。

由于每個miRNA可以有多個靶基因，而幾個miRNAs也可以調節同一個基因。這種復雜的調節網絡既可以通過一個miRNA來調控多個基因的表達，也可以通過幾個miRNAs的組合來精細調控某個基因的表達［1，2］。我們研究結果顯示血清中miR－29a和miR－375表達量的變化具有顯著正相關性，提示miR－29a和miR－375在2型糖尿病的發生、發展中可能具有協同調控作用，其作用機理有待于進一步研究。

綜上所述，本研究證實DM患者血清中的miR－29a和miR－375表達量皆顯著高于對照組。血清中miR－29a和 miR－375表達量的變化與空腹血糖、OGTT 2h血糖和Hb A1c呈顯著正相關，提示miR－29a和miR－375在血清中表達變化有可能作為診斷2型糖尿病的分子標志物。而血清中miR－29a和miR－375表達量的變化具有顯著正相關性提示miR－29a和miR－375在2型糖尿病的發生、發展中可能具有協同調控作用。

［1］Bartel DP.MicroRNAs：target recognition and regulatory functions［J］.Cell，2009，136（2）：215.

［2］Pillai RS，Bhattacharyya SN，Filipowicz W.Repression of protein synthesis by miRNAs：how many mechanisms［J］.Trends Cell Biol，2007，17（3）：118.

［3］Urbich C，Kuehbacher A，Dimmeler S.Role of microRNAs in vascular diseases，inflammation，and angiogenesis［J］.Cardiovasc Res，2008，79（4）：581.

［4］Kumar M，Nath S，Prasad HK，et al.MicroRNAs：a new ray of hope for diabetes mellitus［J］.Protein Cell，2012，3（10）：726.

［5］Zampetaki A，Kiechl S，Drozdov I，et al.Plasma microRNA profiling reveals loss of endothelial miR－126 and other microRNAs in type 2 diabetes［J］.Circ Res，2010，107（6）：810.

［6］Kong L，Zhu J，Han W，et al.Significance of serum microRNAs in pre－diabetes and newly diagnosed type 2 diabetes：a clinical study［J］.Acta Diabetol，2011，48（1）：61.

［7］He A，Zhu L，Gupta N，et al.Overexpression of micro ribonucleic acid 29，highly up－regulated in diabetic rats，leads to insulin resistance in 3T3－L1 adipocytes［J］.Mol Endocrinol，2007，21（11）：2785.

［8］Bagge A，Clausen TR，Larsen S，et al.MicroRNA－29a is up－regulated in beta－cells by glucose and decreases glucose－stimulated insulin secretion［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，426（2）：266.

［9］Poy MN，Hausser J，Trajkovski M，et al.miR－375 maintains normal pancreatic alpha－and beta－cell mass［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106（14）：5813.

［10］Poy MN，Eliasson L，Krutzfeldt J，et al.A pancreatic islet－specific microRNA regulates insulin secretion［J］.Nature，2004，432（7014）：226.

［11］El Ouaamari A，Baroukh N，Martens GA，et al.miR－375 targets 3＇－phosphoinositide－dependent protein kinase－1 and regulates glucose－induced biological responses in pancreatic beta－cells［J］.Diabetes，2008，57（10）：2708.

［12］Chen X，Ba Y，Ma L，et al.Characterization of microRNAs in serum：A novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases［J］.Cell Res，2008，18：997.

［13］Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，et al.Circulating microRNAs as stable blood－based markers for cancer detection［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105：10513.

［14］Ling HY，Wen GB，Feng SD，et al.MicroRNA－375 promotes 3T3－L1 adipocyte differentiation through modulation of extracellular signal－regulated kinase signalling［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2011 ，38（4）：239.

［15］Herrera BM，Lockstone HE，Taylor JM，et al.Global microRNA expression profiles in insulin target tissues in a spontaneous rat model of type 2 diabetes［J］.Diabetologia，2010，53（6）：1099.