腫瘤抑制基因RBM5在非小細胞肺癌組織中表達

梁 紅，王 珂，張 捷

（1.長春市中心醫(yī)院 呼吸內科，吉林 長春 130051；2.吉林大學第二臨床醫(yī)院 呼吸內科）

肺癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤，其中80%～85%的病例為肺小細胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）。據(jù)統(tǒng)計，在歐洲，每年肺癌新發(fā)病例超過20萬，因其死亡的人數(shù)占所有癌癥相關死亡的20%。在美國，每年約有15萬患者死于肺癌［1，2］。在中國大陸，肺癌的發(fā)病率和病死率均呈顯著升高的趨勢。盡管診斷手段，手術技術，化療藥物及化療方法不斷更新、發(fā)展，在過去的30年里肺癌的5年生存率仍然只有13%－15%［3］。吸煙是是肺癌的一個重要的危險因子，85%肺癌患者吸煙。分子學上認為非小細胞肺癌的形成緣于致癌基因的激活及抑癌基因的失活［4］。現(xiàn)存主要治療方法為手術切除、放射線治療、化學療法，但這些療法要受肺癌分期的限制。即使是能手術治療的肺癌，也有半數(shù)以上的復發(fā)率。而且進展期肺癌給予含有鉑劑的化療，有效率也不過30%。生存期的中間值只有12個月。治療方法的研發(fā)是控制肺癌的當務之急。目前正在發(fā)展以癌癥臨床個體化治療為目的系統(tǒng)性癌分子病理闡明研究。近年用于分子靶向藥物治療效果預測的基因檢測，使肺癌治療的個體化成為可能。腫瘤的分子調控是個復雜過程，整個正常細胞網(wǎng)絡調節(jié)過程失控會導致腫瘤發(fā)生。這過程包括細胞增殖，細胞間通信，DNA修復，染色體的穩(wěn)定性，細胞運動，細胞凋亡等。RBM5基因位于3p21.3，是一些腫瘤的基因缺失的熱點區(qū)域，被認為是潛在的腫瘤抑制基，RBM5基因至少編碼4種不同選擇轉錄體，在調節(jié)細胞凋亡，尤其是在調節(jié)腫瘤細胞凋亡中起到重要作用。此基因的結構、功能、腫瘤抑制機制的研究，闡明此基因可能成為未來人類腫瘤診斷、治療的新方法。我們通過對RBM5及凋亡相關基因表達研究，以了解RBM5在非小細胞肺癌發(fā)生中的作用，以其瘤抑制基因RBM5將來成為肺癌治療的新靶點。

1 對象與方法

1.1 組織樣本的制備 原發(fā)肺癌組織及臨近的非腫瘤組織：我們收集了2008年到2009年吉林大學第一及第二臨床醫(yī)學院的外科手術切除的非小細胞肺癌及臨近非腫瘤組織作為實驗樣本。手術切除后快速將所需樣本放入液氮中，直到蛋白被提取。詳細記錄被選患者的臨床信息，包括性別、年齡，腫瘤病理、腫瘤臨床分期使用經(jīng)修訂的肺癌國際分期系統(tǒng)。

1.2 Westeron blot方法檢測 ①檢測蛋白含量：蛋白裂解液提取總蛋白，然后蛋白定量。②配制15%聚丙烯酰胺凝膠。③SDS－PAGE電泳。④免疫印跡雜交（Western blot）半干式。⑤抗體孵育及顯色。特異性條帶的信號采用GIS凝膠成像分析系統(tǒng)處理 ，以各目的條帶與actin光密度比值確定其含量。

2 結果

RBM5蛋白表達結果見表1，圖1。在腫瘤組織中RBM5蛋白表達（P＝0.03）水平均低非腫瘤組織。在腫瘤組織中蛋白低表達率為70%（42／60）。總體上腺癌低表達率為75%（18／24），鱗癌低表達率為66.7%（24／36）。腺癌低表達率較鱗癌高，二者無統(tǒng)計學意義（P＝0.204）。RBM5蛋白在吸煙患者中的低表達率78.6%（33／42）高于非吸煙患者50%（9／18），有統(tǒng)計學意義（P＝0.005）。我們發(fā)現(xiàn)在NSCLC中RBM5蛋白表達缺失與淋巴結轉移有關（P＝0.007）。淋巴結轉移組為83.3%（25／30），無淋巴結轉移組為56.7%（17／30）。與年齡及性別無關（表1）。Fas和Caspase3蛋白表達降低，Bcl－2蛋白表達增高。RBM5和Fas，Caspase3蛋白表達正相關（P＜0.05）。

表1 RBM5在60例非小細胞肺癌中表達的臨床特點

圖1 RBM5，caspase3，F(xiàn)as，bcl－2 western在肺癌組織及癌旁正常組織中的蛋白水平的表達情況

3 討論

RBM5是一個抑癌基因，在腎癌、乳腺癌等多種腫瘤中不同程度表達缺失。自發(fā)現(xiàn)以來其抑癌機制廣受關注，研究發(fā)現(xiàn)RBM5可通過抑制凋亡，調控細胞周期循環(huán)達到抑癌作用。我們收集了臨床外科手術切除的非小細胞肺癌組織及相應的非腫瘤組織，應用Westernblot方法，在蛋白水平研究RBM5基因的表達及與吸煙，病理分型、淋巴結轉移的相關性分析。結果RBM5基因有70%在非小細胞肺癌組織中低表達，已有報道RBM5在乳腺癌及神經(jīng)鞘瘤，及75%原發(fā)肺癌組織中表達降低［5－7］。與我們研究結果基本一致。說明RBM5在3p21.3表達的缺失是雜合子缺失，如果為純合子缺失就不會有RBM5表達。提示RBM5表達的缺失可能是非小細胞肺癌形成的原因之一。RBM5作為抑癌基因，其如何發(fā)揮抑癌作用？以往研究顯示RBM5在成人胸腺中高表達而在胎兒胸腺中低表達，提示RBM5的表達是受發(fā)育調節(jié)的。RBM5在成人胸腺中表達缺失可能導致腫瘤的發(fā)生［8］。自RBM5發(fā)現(xiàn)以來，其抑癌機制廣為關注，研究已經(jīng)證實在乳腺癌細胞CEM－C7及肺癌細胞A549中該基因可抑制細胞增生，促進細胞凋亡。RBM5通過刺激促凋亡蛋白BAX高表達，抑制抗凋亡基因 Bcl－2、Bcl－XL的表達、刺激細胞色素C向胞漿的釋放以及Caspase3和9的激活途徑來介導細胞凋亡過程。最新研究發(fā)現(xiàn)。RBM5還可通過調控Caspase2及FAS的選擇性剪切來介導凋亡。RBM5抑癌作用的研究已經(jīng)比較深入，但對于RBM5基因的研究多局限于細胞研究，本次我們通過對肺癌組織的研究，顯示肺癌組織標本中Bcl－2表達呈上升趨勢（70%，P＜0.05），RBM5，F(xiàn)as和 Caspase3蛋白表達降低，與以往細胞研究結果相符。證實RBM5基因在肺癌組織中的表達缺失的存在，證實其表達缺失是非小細胞肺癌發(fā)病的重要環(huán)節(jié)，同時說明了RBM5正常表達時的抑癌作用，抑制細胞凋亡可能是其抑癌機制之一。在我們研究中RBM5表達缺失多存在于吸煙患者中。以往也有研究顯示在肺癌早期患者及吸煙人群中檢測出RBM5表達缺失。提示RBM5表達異常及其抗腫瘤活性與吸煙有關。另有實驗證明有17個基因在實體瘤中表達降低，多與高轉移率及不良預后相關。RBM5是這17個與實體瘤轉移相關的基因之一。我們的實驗結果顯示RBM5基因表達缺失與淋巴結轉移有關。所以RBM5正常表達或高表達可能會抑制肺癌的發(fā)病、發(fā)展及轉移［9，10］。上述結果說明 RBM5在肺癌發(fā)病中的多樣性及多效性，這可能是RBM5在不同組織類型及不同吸煙狀態(tài)下表達差異的根源。該基因可能作為一復合體與其他基因相互作用。在肺癌的發(fā)病中發(fā)揮其復雜的調控功能。接下來我們將對RBM5在肺癌中表達與其他相關基因的相關性進一步研究，進一步明確RBM5在肺癌中的發(fā)生中的作用及其抑制癌機制進行研究。以期RBM5基因成為新的診斷、治療肺癌的新方法。

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