不同廠家試劑檢測亮氨酸氨基肽酶的方法比對

沃燕波，鄒繼華，黃幸雷，張桂春，馬葵芬

(1、寧波美康生物科技股份有限公司，浙江寧波315100；2、浙江大學醫學院附屬第一醫院，浙江杭州310003)

不同廠家試劑檢測亮氨酸氨基肽酶的方法比對

沃燕波1，鄒繼華1，黃幸雷1，張桂春1，馬葵芬2

(1、寧波美康生物科技股份有限公司，浙江寧波315100；2、浙江大學醫學院附屬第一醫院，浙江杭州310003)

目的對不同廠家試劑檢測亮氨酸氨基肽酶(LAP)結果的可比性及偏倚進行評估。方法依照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)EP9-A2文件規定，連續5 d收集不同濃度范圍分布的40個新鮮血清標本，使用5個不同廠家LAP試劑，每個標本均按正反順序重復兩次，記錄測定結果，檢查離群點、計算線性方程及相關系數，并對其進行偏倚評估。結果各廠家試劑與Randox試劑方法間的相關性良好(r＞0.975)，但僅美康和利德曼試劑與Randox試劑檢測結果的預期偏倚小于允許誤差。結論各廠家的試劑與Randox試劑檢測結果相關性良好，但檢測結果并不完全一致。

亮氨酸氨基肽酶；方法比對；偏倚評估

亮氨酸氨基肽酶(Leucine aminopeptidase，LAP)是一種蛋白分解酶，能水解肽鏈N端以及由亮氨酸與其它氨基酸所形成的肽鍵，廣泛分布于肝、胰和腎等組織中，當這些組織發生病變時其水平升高[1]。研究顯示，LAP對膽汁淤積性肝炎、膽道梗阻及胰腺癌的診斷有價值，其肝癌的檢出陽性率較腺苷脫氨酶高，診斷肝臟疾病比谷氨酰基轉移酶更靈敏，其也可早期反映腎損害的性質和程度，為臨床鑒別腎小球、腎小管損傷提供幫助，其還可作為妊娠期肝內膽汁淤積癥及孕婦和胎兒健康情況動態監測的一項指標[2-4]，因此必須重視其檢測結果的正確性。為此，我們按照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)指南文件EP9-A2要求對5個不同廠家LAP試劑檢測結果進行了比對和偏倚評估[5-7]，以了解不同廠家試劑在檢測LAP時是否存在差異以及測定結果的可比性，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本收集參照文件[5]，收集日常進行LAP檢測的新鮮、無溶血、無黃疸、無乳糜血清標本40份，儲存于4℃冰箱。

1.1.2 LAP試劑購自Randox公司(批號：241695)、日本和光公司(批號：TR370)、北京利德曼公司(批號：204241A)、溫州伊利康公司(批號：111003)、寧波美康生物科技股份有限公司(批號：20120810)。

1.1.3 儀器日立7180全自動生化分析儀。

1.2 方法

1.2.1 樣本測定每天收集檢測范圍均勻分布的8份患者新鮮血清，連續5d，共40份樣本。每份樣本都用5種試劑各自進行雙份測定，測定順序依1～8測定第1次，再按反序8～1測定第2次，以減少交叉污染及漂移對重復測定標本平均值的影響，順序中的濃度應盡可能隨機排列。同一標本均在2 h內完成兩法的測定。

1.2.2 離群值檢查根據文件[5]，對各系統內和方法間進行組內與組間離群值檢查。

1.2.3 作圖及線性關系的目測檢查散點圖1：Y軸為實驗方法每樣本雙份測定的均值(Yi)；X軸為比較方法每樣本份測定的均值(Xi)。散點圖2：Y軸為實驗方法每樣本雙份測定值(Yij)；X軸為參比方法每樣雙份測定的均值(Xi)。偏倚圖1：Y軸為(Yi-Xi)；X軸為(Yi+Xi)/2，以直線X=0作水平中線作圖。偏倚圖2：Y軸為(Yij-Xi)；X軸為(Yi+Xi)/2，以直線X=0作為水平中線作圖。據圖目測評價圖的相對線性、足夠范圍和離散的均勻性。

1.2.4 X值合適范圍的檢驗根據文件進行相關系數計算[5]，如果r≥0.975，則認為X范圍適合，數據滿足要求。X的誤差可以由數據范圍給以適當補償，并且簡單的線性回歸可以用來評價斜率和截距。

1.2.5 線性回歸分析根據文件[5]，計算兩個方法間的線性回歸方程：Y=a+bX。

1.2.6 預期偏倚及可信區間計算根據文件[5]，在醫學決定水平，利用回歸方程計算預期偏倚及95%可信區間，以預設的允許誤差10%為限，將預期偏差的可信區間與之進行比較，當預期偏差可信區間的下限＜允許誤差＜預期偏差可信區間的上限時，實驗方法與比對方法相當；當預期偏差可信區間的上限＜允許誤差時，實驗方法與比對方法相當，偏差可接受；預期偏差可信區間的下限＞允許誤差時，實驗方法與比對方法不相當，偏差不可接受。

1.3 統計學方法所有數據用Excel軟件進行統計處理、作圖分析及偏差評估計算。

2 結果

2.1 散點圖、偏倚圖分析以國際著名診斷試劑廠家Randox試劑檢測系統的測定結果為X，其余各廠家試劑的檢測結果為Y，經組內、組間離群值檢驗后，作散點圖和偏倚圖；從散點圖中可以較為直觀地看出各廠家的試劑與Randox試劑方法間的線性關系良好。如圖1、2為美康試劑與Randox試劑的散點圖，目測可見美康試劑LAP測定值與Randox試劑LAP測定值呈直線關系，說明兩方法相關性較好。偏倚圖1、2分別檢查的是兩種方法重復測定均值間的差異和兩種方法測定值間的差異，反映兩種方法間是否存在系統誤差，從作圖結果來看，美康、利德曼試劑分別與Randox試劑測定同一份血清時差值較小，分布較為合理，而和光試劑測定值普遍高于Randox試劑，伊利康試劑測定值普遍低于Randox試劑，說明兩方法間結果存在差異，并且待測標本的濃度越高，這種差異越大。圖3、4示美康試劑與Randox試劑的偏倚圖。圖5、6示和光試劑與Randox試劑的偏倚圖。

2.2 X值合適范圍的檢驗及線性回歸分析結果如表1所示，各廠家的試劑與Randox試劑的r＞0.975，說明測定范圍足夠寬，誤差的影響可以忽略不計，也說明回歸統計的斜率b和截距a可靠。

圖1 LAP重復測定均值的散點圖

圖2 LAP各次測定結果的散點圖

圖3 LAP重復測定均值偏差圖

圖4 LAP各次測定結果偏差圖

圖5 LAP重復測定均值偏差圖

圖6 LAP各次測定結果偏差圖

表1 相關系數及直線回歸方程

2.3 偏差估計計算預期偏差及其可信限范圍，根據EP9-A2文件提供的公式[5]，并選擇60 U/L作為LAP的醫學決定水平[8,9]，對預期偏倚及可信區間進行計算，判斷兩種檢測方法是否相當。我們以預設的允許誤差10%為限，按照“二分之一允許誤差”的標準[6]，計算得其允許偏倚為3 U/L，由回歸方程計算的預期偏差見表2，結果顯示，美康和利德曼試劑的預期偏差95%可信區間上限＜3 U/L，說明其與Randox試劑偏倚可接受，試劑間檢測結果具有良好的可比性，而和光和溫州伊利康試劑的預期偏差95%可信區間下限＞3 U/L，說明其測定結果與Randox試劑測定結果間的差異較為顯著，超出了預設的允許誤差范圍，方法間所得的檢測結果不一致。

表2 預期偏倚及可信區間的比較

3 討論

LAP位于細胞的微粒體內，在肝臟主要定位于毛細膽管上皮細胞，不同肝病其活性增高程度不同，由高至低為依次肝癌、急性肝炎、肝硬化、慢性肝炎，其中肝癌陽性檢出率最高，因此，LAP作為肝癌鑒別診斷的一項初步指標，值得推廣[1]。此外，由于LAP不像其他肝功能酶，只能檢測血液樣本，其還可以檢測尿液，在一些病例中可以不必采血而進行檢驗，因此應用起來十分方便[10]。本實驗根據CLSI EP9-A2文件的流程[5-7]，對市場上5個廠家試劑的測定結果進行比對，結果顯示，各廠家試劑的檢測結果的重復性均較好，沒有方法內和方法間離群值，當以國際著名診斷試劑廠家Randox試劑的檢測系統為比較方法時，其余各廠家試劑與其的線性關系良好，說明各廠家試劑與Randox試劑的相關性較好。進一步我們通過偏差估計發現，美康和利德曼試劑與Randox試劑偏倚可接受，說明美康和利德曼試劑與Randox試劑的檢測結果具有良好的可比性，而和光和溫州伊利康試劑測定結果與Randox試劑測定結果間的差異較為顯著，由回歸方程計算的預期偏差超出了預設的允許誤差范圍，可見，和光和溫州伊利康試劑與Randox試劑所得的檢測結果不一致。由于目前還沒有LAP的參考物質，且還未制定出參考測量程序，因而尚難對各廠家測定結果的正確性做出判斷，但根據本研究的圖形分析及相關回歸分析可知，各試劑在檢測范圍內相關性良好，因此根據回歸方程對檢測結果進行系數調整，可使方法間測定結果具有一致性與可比性。

[1]紀曉霞,陳林.亮氨酸氨基肽酶的基礎研究及臨床應用[J].海峽藥學,2011,23(12):175-177.

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Method comparision of the kits from different manufactures in detecting of Leucine aminopeptidase

WO Yanbo,ZOU Ji- hua,HUANG Xinglei,et al.Ningbo Medicalsystem Biotechnology Co.,Ltd,Zhejiang Ningbo 315100，China

ObjectiveTo assess the comparability and bias of the LAP test results detected with leucine aminopeptidase(LAP) reagent from different manufacturers.Methods According to US National Clinical Laboratory Standards Committee(CLSI)EP9-A2, forty fresh serum samples covering different concentrations were continuously collected for 5 days.The collected samples were detected using LAP reagents made by 5 different manufacturers.Each sample was measured twice with the positive and negative order.The results were recorded to check the outliers and to calculate the linear equations and correlation coefficients,and to estimate the bias.Results The correlation between the tested reagents made by different manufacturers and Randox reagent was good (r＞0.975).Compared with Randox reagent,the expected bias of the results detected with the reagents manufactured by Meikang and Lideman was less than the allowable error region.Conclusion Though the correlation of the tested reagents is good,the detection results are not consistent.

Leucine aminopeptidase;Method comparison;Bias estimation

R446.11+2

A

1674-1129(2013)01-0010-3

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.01.004

浙江省中醫藥科學研究基金(No 2011ZA053)

沃燕波，女，1980年生，畢業于浙江大學，醫學博士，中級工程師，從事體外診斷試劑開發研究。