低分子肝素對人乳腺癌細胞MCF-7侵襲抑制實驗研究

龐 新，王 鵬

（1.河北省保定市第三醫院普內科，河北保定071000；2.河北省保定市第二醫院腫瘤內科，河北保定071000）

·論 著·

低分子肝素對人乳腺癌細胞MCF-7侵襲抑制實驗研究

龐 新1，王 鵬2

（1.河北省保定市第三醫院普內科，河北保定071000；2.河北省保定市第二醫院腫瘤內科，河北保定071000）

目的探討低分子肝素（lowmolecularweightheparin，LMWH）抑制人乳腺癌細胞MCF-7的侵襲作用及其機制。方法采用四甲基偶氮唑藍比色法檢測LMWH素對人乳腺癌細胞MCF-7黏附的影響，采用Transwell小室法檢測LMWH對該細胞的遷移、侵襲的抑制作用，采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）法半定量檢測LMWH處理細胞24h后組織因子（tissue factor，TF）mRNA的表達水平。結果MTT比色法分析檢測顯示，LMWH對MCF-7細胞與細胞外基質成分Matrigel黏附力的抑制作用呈劑量效應依賴關系。遷移和侵襲實驗顯示，LMWH對MCF-7細胞的遷移和侵襲抑制均呈劑量-效應依賴關系。半定量RT-PCR檢測結果顯示，LMWH處理后MCF-7細胞TFmRNA表達水平較對照組明顯降低。結論LMWH可通過下調TFmRNA表達水平抑制人乳腺癌細胞MCF-7黏附、遷移、侵襲。

乳腺腫瘤；肝素，低分子量；腫瘤轉移

侵襲和轉移是惡性腫瘤重要的生物學特征，作為女性高發的惡性腫瘤，乳腺癌在早期即可出現全身轉移。因此，對乳腺癌侵襲和轉移的防治成為腫瘤研究的熱點。肝素類化合物在抑制惡性腫瘤侵襲、轉移中的作用已得到證實，但機制尚未完全明確。本研究探討低分子肝素（low molecular weight heparin，LMWH）對乳腺癌細胞侵襲和轉移的影響和作用機制。報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與來源：人乳腺癌細胞MCF-7購自中國科學院上海細胞所。低分子肝素（法瑪西亞普強德

國有限公司）；RPMI-1640培養基、胰蛋白酶（美國GIBCOL公司）；胎牛血清、四甲基偶氮唑藍（tetrzolium-based colorimetric assay，MTT）（北京華美生物工程公司）；TrizolTMReagent、Oligo（dT）15 Primer、AMV Reverse Transcriptase Go Tap Green Master Mix（美國Promega公司）；Matrigel（美國BD公司）；Transwell小室和24孔板（美國Corning公司）；PCR擴增儀（美國ABI公司）。

1.2 細胞培養及制備細胞懸液：將MCF-7細胞培養于含10％胎牛血清的RPMI-1640培養基中，置于37℃、飽和濕度、5％CO2的恒溫培養箱內常規傳代培養。取對數生長期細胞進行實驗。

1.3 黏附實驗測定黏附抑制率：96孔板每孔用Matrigel 30μL包被、2％牛血清白蛋白（bovine serum aibumin，BSA）封板，每組設3個復孔。用不同濃度（0、25、50、100U/mL）LMWH處理MCF-7細胞24h后，胰酶消化、PBS洗滌，制成5×105個/mL細胞懸液，200μL/孔加入96孔板內。于恒溫培養箱內，分別孵育60、90、120min棄去各孔培養液，PBS沖洗除去未黏附的細胞。加無血清RPMI-1640 200μL/孔，MTT溶液20μL/孔，孵育4h。棄MTT液，加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150μL/孔，溶解振蕩10min，自動酶標儀570nm波長下測各孔A570值，計算細胞黏附抑制率。黏附抑制率=（對照組OD值-實驗組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100％。

1.4 體外侵襲實驗：將Transwell置于24孔板內，在小室上室面底部聚碳酯膜上均勻鋪上1∶5 RPMI1640稀釋的Matrigel 40μL/孔，成膠30min后，置超凈臺紫外燈照射過夜。實驗前再次成膠，設對照組及處理組（25、50、100U/mL濃度LMWH處理24h）細胞，調整濃度為10.0×105/mL的細胞懸液200μL接種到成膠的Transwell小室內。在24孔板內（小室下層）加600μL含10％胎牛血清的RPMI-1640培養基培養24h。取出小室擦掉Matrigel，沖洗，固定，HE染色。揭下聚碳酯膜反貼在載玻片上，樹膠封片，在光鏡（×200）下，每個膜隨機選取上、下、左、右、中心5個視野，計數穿膜細胞數，計算細胞侵襲抑制率。侵襲抑制率=（對照組細胞侵襲數-處理組細胞侵襲數）/對照組細胞侵襲數× 100％。

1.5 遷移實驗：內聚碳酯濾膜表面不鋪Matrigel，后繼步驟與侵襲實驗相同。通過計數穿過膜的細胞數反映細胞的運動能力。計算細胞遷移抑制率。遷移抑制率=（對照組細胞遷移數-處理組細胞遷移數）/對照組細胞遷移數×100％。

1.6 逆轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）半定量檢測MCF-7細胞因子（tissua factor，TF）mRNA的表達水平：取對數生長期細胞，設置溶劑對照組和處理組（25、50、100U/mL濃度LMWH處理24h）。分別提取細胞總RNA。調整總RNA濃度為1μg/μL。取總RNA 2μL，進行逆轉錄。逆轉錄反應條件，70℃10min，25℃1min，42℃60min（cDNA合成），94℃5min。然后以該cDNA為模板進行PCR反應，βactin引物序列，5'-GTGGGGCGCCCC-AGGCACCA-3'（sence），5'-CTCCTTAATTAATGTCA-CGCACGATTTC-3'（anti-sence），擴增片段長度為517bp，退火溫度60℃，30個循環。TF引物序列，5'-TACGAGGCTTTATGAGTAAAC-3'（sence），5'-GCCTGGGCAACAGAGCAA-3'（anti-sence），擴增片段長度為356bp，退火溫度60℃，30個循環。

擴增產物在15g/L的瓊脂糖凝膠電泳30min，以DNAMarker作為標準分子量標記，電泳后于紫外透射儀觀察，應用美國FOTODYNE凝膠成像分析系統對目的電泳條帶進行分析。

1.7 統計學方法：應用SPSS14.0統計軟件分析數據，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 黏附抑制率：不同濃度LMWH（25、50、100U/mL）處理細胞60～120min后，與對照組相比，各處理組OD值均有不同程度下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。60、90、120min黏附抑制率分別為13.88％、30.18％、42.51％，13.70％、26.51％、44.43％，17.75％、32.47％、48.20％，細胞的黏附抑制率均有隨藥物濃度增大而增高的趨勢。見表1。表明25～100U/mL濃度LMWH對MCF-7細胞的黏附能力均有明顯的抑制作用。

2.2 LMWH對MCF-7細胞侵襲力的影響：不同濃度（25、50、100U/mL）的LMWH處理24h后，與對照組相比，各處理組細胞侵襲數均有不同程度下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。細胞侵襲抑制率分別為24.67％、50.49％、84.15％。見表2。表明25～100U/mL濃度LMWH對MCF-7細胞的侵襲能力均有明顯的抑制作用。

表1 LMWH對MCF-7細胞黏附能力的影響Table 1 Effect of LMWH on adhesive ability of MCF-7 cells（n=3，±s，OD）

表1 LMWH對MCF-7細胞黏附能力的影響Table 1 Effect of LMWH on adhesive ability of MCF-7 cells（n=3，±s，OD）

*P＜0.05 vs 0U/mL group #P＜0.05 vs 25U/mL △P＜0.05 vs 50U/mL by ANOVA test

Groups（U/mL）Adhesive ability ofMCF-7 cells 60min 90min 120min 0 0.454±0.061 0.664±0.035 0.890±0.018 25 0.391±0.056*0.573±0.064*0.732±0.029*50 0.317±0.023*#0.488±0.074*#0.601±0.062*#100 0.261±0.022*#△0.369±0.023*#△0.461±0.045*#△

表2 LMWH對MCF-7細胞侵襲力的影響Table 2 Effect of LMWH on invasive ability of MCF-7 cells

2.3 LMWH對MCF-7細胞運動能力的影響：不同濃度（25、50、100U/mL）的LMWH處理24h后，與對照組相比，各處理組細胞遷移數均有不同程度下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。細胞遷移抑制率分別為23.12％、36.95％、58.78％。見表3。表明25～100U/mL濃度LMWH對MCF-7細胞的運動能力均有明顯的抑制作用。

表3 LMWH對MCF-7細胞運動能力的影響Tab le 3 Effect of LMWH on m igrative ability of MCF-7 cells

2.4 半定量RT-PCR法檢測LMWH對MCF-7細胞TFmRNA表達的影響：經25、50、100U/mL LMWH作用MCF-7細胞24h后，TFmRNA的表達水平隨處理濃度增大而逐漸減弱。藥物處理前MCF-7細胞TF/β-actin比值為0.591±0.035，當LMWH處理24h后MCF-7細胞的TF/β-actin比值分別為0.369±0.038、0.276±0.015、0.190±0.002，作用前后差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討 論

侵襲和轉移是惡性腫瘤的標志，是其致死的主要原因。腫瘤侵襲轉移是一個連續、漸進的多步驟動態過程，包括黏附、運動、增殖、基質降解以及新生血管形成等多步驟信號級聯反應。研究［1］發現，LMWH能進入某些惡性腫瘤細胞內部而抑制腫瘤生長和有關基因的表達。Marchetti等［2］研究證明，LMWH能夠顯著抑制乳腺癌和白血病中多種細胞因子誘導的毛細血管形成作用。

本研究結果顯示濃度在0～100U/mL之間時，隨著LMWH濃度的增高，對細胞侵襲的抑制能力逐漸增加。MCF-7細胞侵襲能力的下降可能是其黏附能力和運動能力下降共同作用的結果。本研究黏附實驗和遷移實驗中證實了這一點，并發現LMWH抑制乳腺癌MCF-7細胞的侵襲、轉移與下調其TF基因表達有關。

TF即凝血因子Ⅲ，為單鏈跨膜糖蛋白，屬于細胞因子超家族成員，是生理性止、凝血過程及多種病理性血栓形成的啟動因子。研究［3-5］已證實在結直腸癌、惡性黑色素瘤、胰腺癌中，TF表達水平與其惡性程度、臨床分期和預后密切相關。

在浸潤性乳腺癌中存在TF高表達的成肌纖維細胞圍繞在腫瘤細胞周圍，這些表達TF的細胞與細胞外基質改變常同時出現［6］，提示其與腫瘤的侵襲性密切相關。Ueno等［7］認為乳腺癌中TF的表達可作為預計生存期的獨立預后因素，可對評價乳腺癌患者的遠期轉移和復發提供有效的前瞻性價值。楊莉等［8］研究也發現乳腺癌有淋巴結轉移患者TF表達高于無轉移患者，并且TF表達越強，淋巴結轉移可能性越大，預后越差。表明TF有明顯促進乳腺癌細胞侵襲轉移的作用。Poon等［9］認為TF促進腫瘤細胞侵襲轉移的原因，是促進腫瘤血管的生成并影響細胞間黏附和細胞外基質降解。腫瘤細胞的TF表達與血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達、微血管密度（microvessel density，MVD）呈正相關。特別是TF分子胞內區末端3個絲氨酸殘基磷酸化具有細胞內信號傳導功能，能促進VEGF的轉錄和合成，而VEGF也可促進TF的表達，TF—VEGF—TF這種正反饋的調節機制促進了腫瘤的生長和血管的形成的惡性循環過程。TF上調的白細胞介素1、白細胞介素8也有強烈誘導血管生成作用。肝素類化合物可抑制TF的表達，而LMWH對TF的抑制作用強于普通未分級肝素（unfractionated heparin，UFH），有更強的抑制新生血管的作用。劉飛等［10］研究證實，通過LMWH的干預，裸鼠MCF-7移植瘤中VEGF的活性顯著被抑制，MVD值明顯下降。

同時，表達TF的腫瘤細胞與重組FⅦa或抗TF

抗體結合后通過肌動蛋白的多聚產生細胞內的信號傳導上調基質金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMPs）表達。這些蛋白酶的高表達破壞基質的降解平衡，促進腫瘤細胞突破基底膜和細胞外基質構成的組織化學屏障，侵襲周圍組織并轉移至遠處。LMWH不僅通過抑制TF表達下調部分MMPs，其自身所帶的負電荷也抑制了MMPs的活性。

TF與腫瘤之間的關系及相互作用的機制仍值得進一步探討。但TF在腫瘤生長、侵襲、轉移中的活躍作用使之成為腫瘤治療中極具吸引力的靶點。本研究發現LMWH能顯著降低TF基因表達，抑制乳腺癌MCF-7細胞的侵襲。此外，LMWH在體內還可通過促進組織因子旁路抑制劑（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）釋放抑制腫瘤部位新生血管生成［11］。這可能是LMWH在體內抑制TF的另一種途徑。體外實驗雖然不能真正模擬體內乳腺癌侵襲和轉移的器官微環境和轉移效果，但是能在一定程度上反映LMWH對乳腺癌細胞的運動和侵襲能力的影響，為預防乳腺癌生長、浸潤、轉移提供了新的、有益的借鑒。

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（本文編輯：趙麗潔）

EFFECTSOF LOW MOLECULAR WEIGHT HEPARIN ON INVASIVENESS OF HUMAN BREAST CANCER CELL LINE MCF-7 ABSTRACT

PANG Xin1，WANG Peng2
（1.Department of Internal Medicine，the Third Hospital of Baoding，Hebei Province，Baoding 071000，China；2.Department of Medical Oncology，the Second Hospital of Baoding，Hebei Province，Baoding 071000，China）

Objective To study the effects of low molecular weight heparin（LMWH）on invasiveness of human breast cancer cell line MCF-7 and itsmechanisms.MethodsTetrzolium-based colorimetric assay（MTT）colorimetricmethod was used to detect the effect of LMWH on the adhesion of human breast cancer cellline MCF-7.The expression of tissue factor（TF）mRNA was semiquantitatively detected by reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）in MCF-7 cells after being treated with LMWH for 24h.ResultsLMWH inhibited the adhesion of MCF-7 cells significantly in a dosedependentmanner.LMWH inhibited the invasive and metastatic abilities of MCF-7 cells significantly in a dose-dependentmanner.The results of RT-PCR showed that the expression of TFmRNA decreased after LMWH treatment for 24h compared to that of control group.ConclusionLMWH inhibited the adhesive，metastatic and invasive abilities of MCF-7 cells by down-regulating the expression of TFmRNA.

breast neoplasms；heparin，low-molecular-weight；neoplasm metastasis

R737.9

A

1007-3205（2013）06-0657-04

2012-10-24；

2013-12-16

龐新（1978-），女，河北清苑人，河北省保定市第三醫院主治醫師，醫學碩士，從事消化內科疾病診治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.06.014