子宮內(nèi)膜癌端粒酶催化亞單位表達(dá)與DNA含量的相關(guān)性研究

趙文波，樊愛軍，樓正青，王育瑛

（浙江省杭州市中醫(yī)院檢驗科，浙江杭州310007）

·論 著·

子宮內(nèi)膜癌端粒酶催化亞單位表達(dá)與DNA含量的相關(guān)性研究

趙文波，樊愛軍，樓正青，王育瑛

（浙江省杭州市中醫(yī)院檢驗科，浙江杭州310007）

目的探討子宮內(nèi)膜組織中端粒酶催化亞單位（human telomerase reverse transcriptase，hTRT）表達(dá)與DNA含量對子宮內(nèi)膜癌的診斷意義以及二者之間的關(guān)系。方法采用原位雜交法對子宮內(nèi)膜癌40例、子宮內(nèi)膜不典型增生20例及正常子宮內(nèi)膜組織8例的hTRT表達(dá)進(jìn)行檢測；用流式細(xì)胞儀檢測3種組織細(xì)胞的DNA含量。結(jié)果子宮內(nèi)膜癌組織hTRT表達(dá)陽性率為87.5％，明顯高于正常子宮內(nèi)膜與子宮內(nèi)膜不典型增生組織（P＜0.01）；而且子宮內(nèi)膜不典型增生組織hTRT表達(dá)陽性率（40.0％）高于正常子宮內(nèi)膜（12.5％）。從正常子宮內(nèi)膜到子宮內(nèi)膜不典型增生及子宮內(nèi)膜癌，DNA指數(shù)值與S期細(xì)胞百分比值逐漸增高（P＜0.05）。hTRT陽性腫瘤組織中異倍體腫瘤（28/35）明顯高于hTRT陰性腫瘤組織（1/5）。結(jié)論從正常子宮內(nèi)膜到子宮內(nèi)膜不典型增生及子宮內(nèi)膜癌，hTRT表達(dá)陽性率及DNA含量逐漸增高，提示hTRT陽性表達(dá)和DNA含量的增高與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展高度相關(guān)，對子宮內(nèi)膜癌的診斷具有重要意義。

子宮內(nèi)膜腫瘤；端粒，末端轉(zhuǎn)移酶；診斷

子宮內(nèi)膜癌是危害女性健康的主要惡性腫瘤之一，近年來，其發(fā)病率呈上升趨勢。對子宮內(nèi)膜癌及時而準(zhǔn)確的診斷是降低其病死率的關(guān)鍵，因此，人們

一直在努力尋找子宮內(nèi)膜癌診斷的理想指標(biāo)。端粒酶活化是正常組織細(xì)胞向惡性演變過程中的重要步驟，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTRT）又稱端粒酶催化亞單位，是端粒酶的重要組成部分，與酶活性密切相關(guān)，被認(rèn)為是激活端粒酶的限速酶［1］。目前，端粒酶及其組分與惡性腫瘤的關(guān)系已引起人們的廣泛關(guān)注。本研究采用原位雜交法分別檢測正常、不典型增生及癌變子宮內(nèi)膜組織hTRT的表達(dá)，同時采用流式細(xì)胞術(shù)檢測其DNA含量，探討hTRT及DNA含量在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用并初步揭示二者之間的關(guān)系，以期為子宮內(nèi)膜癌的臨床診斷及治療提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源：68例子宮內(nèi)膜組織石蠟切片取材時間為2008年6月—2010年9月?；颊吣挲g28～79歲，中位年齡60歲。子宮內(nèi)膜癌40例，其中高分化癌11例，中分化癌23例，低分化癌6例；子宮內(nèi)膜不典型增生20例，其中輕度不典型增生6例，中度不典型增生12例，重度不典型增生2例；正常宮內(nèi)膜組織8例，其中增殖期5例，分泌期3例。所有標(biāo)本均經(jīng)病理確診。每例標(biāo)本切取4μm、50μm切片各3張。

1.2 主要試劑及設(shè)備：hTRT原位雜交試劑盒由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理教研室提供；FACSCalibur流式細(xì)胞儀及Cycle TESTTMPLUSDNA REAGENT KIT試劑盒為美國B-D公司產(chǎn)品。

1.3 hTRT檢測：按原位雜交試劑盒說明書進(jìn)行操作，4μm組織切片常規(guī)脫蠟、水化→0.3％H2O2封閉→0.1mol/L HCl處理→蛋白酶K消化→4％多聚甲醛后固定→滴加雜交液20μL/片，封口膜覆蓋后放入含50％甲酰胺2×檸檬酸鹽緩沖液的濕盒中，42℃雜交過夜，PBS代替探針作陰性對照→切片于2×檸檬酸鹽緩沖液中洗3次→馬血清封閉后滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉素含素→二氨基聯(lián)苯胺-H2O2顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹脂封片鏡檢。顯微鏡下觀察，胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為hTRT陽性。弱陽性（+），陽性信號面積＜25％；陽性（++），陽性信號面積25％～50％；強陽性（+++），陽性信號面積＞50％。無棕黃色顆粒出現(xiàn)者為hTRT陰性。

1.4 DNA含量分析：每例標(biāo)本取50μm組織片3張置于大試管中，常規(guī)脫蠟、水化；每管加檸檬酸鹽緩沖液5mL，置80℃2h［3］，離心棄上清；加0.5％胃蛋白酶消化液4mL（生理鹽水配制，用HCl調(diào)pH值為1.5），37℃水浴孵育30min，消化期間，每隔5 min振蕩懸浮1次；加生理鹽水終止消化，1 500r/min離心5min，棄上清；加5mL PBS，800r/min離心2min去除細(xì)胞碎片；200目尼龍網(wǎng)濾去未消化組織碎片，收集濾液，PBS離心洗滌2次，顯微鏡下計數(shù)，調(diào)節(jié)每管細(xì)胞數(shù)為5×105，離心棄上清；加試劑盒A液250μL，室溫10min；加B液200μL，室溫10min；加C液200μL，4℃避光10min；500目尼龍網(wǎng)過濾，流式細(xì)胞儀檢測。標(biāo)本檢測前，以DNA QC PARTICLES試劑盒校正流式細(xì)胞儀，調(diào)節(jié)電壓及熒光強度。以淋巴細(xì)胞分離液分離人外周血單個核細(xì)胞作為外標(biāo)樣品，與子宮內(nèi)膜細(xì)胞同時進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。每份標(biāo)本收取15 000個細(xì)胞。以DNA指數(shù)（DNA index，DI）表示相對DNA含量，DI=樣品G0/G1期峰均道值/正常子宮內(nèi)膜G0/G1期峰均道值。嚴(yán)格來說，二倍體或四倍體細(xì)胞的DI值應(yīng)為1或2，但由于石蠟切片在處理過程中會產(chǎn)生碎片，檢驗方法學(xué)也會存在誤差，均會導(dǎo)致一些變異。故一般將二倍體的DI值定為0.9～1.1，DI值在此范圍之外者則為異倍體。最后，采用B-D公司提供的ModFit LT軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析，計算標(biāo)本的S期細(xì)胞百分比（S phase fraction，SPF）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以±s表示，采用方差分析；相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析；計數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 hTRT表達(dá)情況：hTRT陽性信號主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，為棕黃色顆粒。正常子宮內(nèi)膜組織hTRT陽性表達(dá)較少見且為弱陽性；子宮內(nèi)膜不典型增生及子宮內(nèi)膜癌組織hTRT表達(dá)主要為陽性，并且子宮內(nèi)膜癌組織hTRT表達(dá)出現(xiàn)較多的強陽性。子宮內(nèi)膜癌組織hTRT陽性率為87.5％（35/40），正常子宮內(nèi)膜組織hTRT陽性率為12.5％（1/8），二者相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；子宮內(nèi)膜不典型增生組織hTRT陽性率為40％（8/20），與正常子宮內(nèi)膜組織差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與子宮內(nèi)膜癌組織相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。從正常、不典型增生到癌變子宮內(nèi)膜，hTRT陽性強度逐漸增強（rs=0.605，P＜0.01）。見表1。

表1 子宮內(nèi)膜組織hTRT表達(dá)Table 1 Expression of hTRT in endometrial tissue

2.2 DNA含量檢測結(jié)果：8例正常子宮內(nèi)膜組織細(xì)胞DNA含量均為二倍體，DNA以G0/G1期細(xì)胞群為主，S期細(xì)胞峰光滑平坦，G2M期細(xì)胞出現(xiàn)小峰；20例不典型增生子宮內(nèi)膜中二倍體12例，DNA顯示S期細(xì)胞峰稍高，G2M期細(xì)胞峰亦有增高；40例子宮內(nèi)膜癌組織中二倍體11例，DNA顯示S期及G2M期細(xì)胞峰均高于正常子宮內(nèi)膜組織。異倍體不典型增生及異倍體腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)明顯的異倍體峰。子宮內(nèi)膜癌組織異倍體率為72.5％（29/40），明顯高于子宮內(nèi)膜不典型增生組織（P＜0.05）及正常子宮內(nèi)膜（P＜0.01）；子宮內(nèi)膜不典型增生組織異倍體率為40.0％，與正常子宮內(nèi)膜相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。從正常、不典型增生到內(nèi)膜癌組織，DI值及SPF值逐漸增高（P＜0.05）。見表2，3。

表4 子宮內(nèi)膜癌組織hTRT表達(dá)與DNA倍體的關(guān)系Table 4 Endom etrial cancer tissue hTRT exp ression and DNA p loidy relationship （n）

表2 3種子宮內(nèi)膜組織DNA倍體Table 2 Three kinds of endometrial tissues DNA ploidy

表3 子宮內(nèi)膜組織DI值及SPF值分布Table 3 Endometrial tissue DI value andSPF value distribution （±s）

表3 子宮內(nèi)膜組織DI值及SPF值分布Table 3 Endometrial tissue DI value andSPF value distribution （±s）

*P＜0.05 vs normal #P＜0.05 vs typical hyperplasia by ANOVA test

Endometrial tissues n DI SPF（％）Normal 8 1.01±0.07 8.21±2.30 Typical hyperplasia 20 1.16±0.13*13.66±3.22*Endometrial carcinoma 40 1.43±0.18*#23.62±4.69*#

2.3 子宮內(nèi)膜癌組織hTRT表達(dá)與DNA倍體的關(guān)系：hTRT表達(dá)陰性的子宮內(nèi)膜癌組織多為二倍體，異倍體僅占20％（1/5）；hTRT表達(dá)陽性者則多為異倍體，異倍體比例為80.0％（28/35）。hTRT表達(dá)陽性腫瘤組織異倍體率明顯高于陰性腫瘤組織（P＜0.05），hTRT表達(dá)與DNA倍體之間存在一定聯(lián)系（rs=0.44，P＜0.01）。見表4。

3 討 論

3.1 hTRT檢測對子宮內(nèi)膜癌的診斷意義：研究［2］表明大多數(shù)人類惡性腫瘤及永生化細(xì)胞中端粒酶活性顯著增高，端粒酶活化與細(xì)胞的異常增殖密切相關(guān)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起非常重要的作用。hTRT的表達(dá)與端粒酶的活性表達(dá)完全一致，在原發(fā)性腫瘤、癌細(xì)胞系以及端粒酶陽性表達(dá)的組織中hTRT均有較高表達(dá)［3］。檢測hTRT的表達(dá)已成為端粒酶活性檢測的又一主要方法。Oshita等［4］對36例子宮內(nèi)膜癌的端粒酶活性和hTRT表達(dá)進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)端粒酶活性與hTRT的陽性率基本一致，并且均明顯高于正常子宮內(nèi)膜。本研究采用原位雜交法檢測hTRT在子宮內(nèi)膜石蠟包埋組織中的表達(dá)，即可間接反映出端粒酶活性的高低，又克服了以往方法標(biāo)本限制問題。本研究結(jié)果表明，hTRT主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，40例子宮內(nèi)膜癌組織中有35例hTRT陽性，陽性率87.5％，明顯高于正常及不典型增生子宮內(nèi)膜組織，與文獻(xiàn)報道接近［5］。在8例正常子宮內(nèi)膜組織中，有1例hTRT陽性。由于子宮內(nèi)膜癌多發(fā)生于絕經(jīng)后婦女，因此，hTRT檢測對于子宮內(nèi)膜癌的診斷仍具有重要價值。

3.2 子宮內(nèi)膜癌的DNA含量變化：腫瘤細(xì)胞特別是惡性腫瘤細(xì)胞的DNA含量多有不同程度的升高，DNA異倍體的出現(xiàn)則是惡性腫瘤的特征性標(biāo)志之一。隨著流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤研究中的廣泛應(yīng)用，DNA含量分析與腫瘤臨床因素的關(guān)系引起人們越來越多的關(guān)注。國內(nèi)外學(xué)者一致認(rèn)為，DNA倍體分析可作為評價預(yù)后的獨立指標(biāo)［6］。關(guān)于DNA含量分析在子宮內(nèi)膜癌診斷方面的意義，目前國內(nèi)外報道極為少見。張蓉等［7］采用流式細(xì)胞術(shù)對30例子

宮內(nèi)膜癌患者腫瘤新鮮組織進(jìn)行DNA含量分析，結(jié)果異倍體率為56.7％。本研究40例子宮內(nèi)膜癌中異倍體29例，異倍體率72.5％，內(nèi)膜癌組DNA異倍體率明顯高于正常組及不典型增生組。究其原因很可能是我們采用的石蠟切片標(biāo)本在細(xì)胞制備過程中產(chǎn)生的細(xì)胞碎片較多，致使測試結(jié)果偏高。從正常子宮內(nèi)膜到子宮內(nèi)膜不典型增生及子宮內(nèi)膜癌，DI值與SPF值逐漸增高。這表明DNA含量變化與子宮內(nèi)膜癌演進(jìn)過程密切相關(guān)，DNA含量分析對子宮內(nèi)膜癌的診斷及其與癌前病變的鑒別診斷具有重要價值，增生子宮內(nèi)膜中出現(xiàn)較高DI值及SPF值可能提示惡變幾率的升高。

3.3 hTRT的表達(dá)與DNA含量分析：hTRT表達(dá)與DNA含量異常之間可能存在某種聯(lián)系，在細(xì)胞分裂過程中，端粒逐漸縮短，細(xì)胞停止分裂退出細(xì)胞周期而凋亡。由此可見，端粒的持續(xù)縮短降低了染色體的穩(wěn)定性，使染色體容易發(fā)生畸變，此時細(xì)胞便表現(xiàn)為異倍體，同時端粒的過度縮短也是端粒酶激活的重要原因。本研究中hTRT陽性的內(nèi)膜癌組織異倍體占80.0％，hTRT陰性者異倍體占20.0％，hTRT陽性內(nèi)膜癌的異倍體率明顯高于hTRT陰性者。有學(xué)者［8-9］認(rèn)為異倍體腫瘤端粒酶活性明顯高于非異倍體腫瘤。本研究結(jié)果顯示hTRT表達(dá)與DNA倍體之間存在一定聯(lián)系，表明二者聯(lián)合檢測能進(jìn)一步提高子宮內(nèi)膜癌診斷的準(zhǔn)確性，同時也提示hTRT可能對子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后判斷具有一定意義。由于本研究患者無隨訪資料，有關(guān)hTRT表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的關(guān)系尚有待研究。此外，因樣本例數(shù)較少，有關(guān)hTRT表達(dá)及DNA含量與子宮內(nèi)膜癌組織學(xué)類型、病理分級的關(guān)系也有待于進(jìn)一步研究。

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（本文編輯：趙麗潔）

EXPRESSION OF HUMAN TELOMERASE REVERSE TRANSCRIPTASE AND DNA CONTENT IN ENDOMETRIAL CARCINOMA

ZHAOWenbo，F(xiàn)AN Aijun，LOU Zhengqing，WANG Yuying
linical Laboratory，Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Zhejiang Province，Hangzhou 310007，China）

Objective To investigate the value of human telomerase reverse transcriptase（hTRT）and DNA contents in the diagnosis of endometrial carcinoma and to evaluate the relationship between the expression of hTRT and DNA content in endometrial carcinoma.MethodsThe expression of hTRT in 40 cases of endometrial carcinoma，20 cases of endometrial atypical hyperplasia and 8 cases of normal endometrium were detected by in situ hybridization.The DNA contents of the three kinds of tissue were detected by flow cytometry.ResultsThe positive rate of hTRT in endometrial carcinoma（87.5％）was remarkably higher than those in endometrial atypical hyperplasia（40.0％）and normal endometrium（12.5％），respectivel（y P＜0.01）.The difference of DNA index and S-phase fraction among the three groups were significant（P＜0.05）.The aneuploid rate（28/35）of hTRT-positive carcinoma was significantly higher than that（1/5）of hTRT-negative（P＜0.05）.ConclusionFrom normal endometrium to endometrial atypical hyperplasia and endometrial carcinoma，the expression of hTRT and DNA content increased gradually，indicating hTRT positive expression and increased DNA content being closely related to the progress of endometrial carcinoma，both of them played important role in the diagnosis of endometrial carcinoma.

endometrial neoplasms；telomerase；diagnosis

R737.33

A

1007-3205（2013）06-0674-04

2012-10-22；

2013-01-29

趙文波（1974-），男，浙江杭州人，浙江省杭州市中醫(yī)院主管技師，醫(yī)學(xué)碩士，從事免疫學(xué)檢驗及相關(guān)研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.06.020