人腦血管母細(xì)胞瘤中VEGF和bFGF的表達(dá)及與血管生成的關(guān)系

劉 敏，李 嵩，趙 運(yùn)

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院康復(fù)科，河北石家莊 050000；2.中國(guó)人民解放軍軍械工程學(xué)院門診部，河北石家莊 050000）

人腦血管母細(xì)胞瘤中VEGF和bFGF的表達(dá)及與血管生成的關(guān)系

劉 敏1，李 嵩2，趙 運(yùn)1

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院康復(fù)科，河北石家莊 050000；2.中國(guó)人民解放軍軍械工程學(xué)院門診部，河北石家莊 050000）

目的探討血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）在人腦血管母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及與腫瘤血管形成的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)S-P法檢測(cè)32例人腦血管母細(xì)胞瘤及10例正常腦組織中VEGF和bFGF表達(dá)，以CD34單克隆抗體標(biāo)記瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞并測(cè)定微血管密度（microvessel density，MVD）。結(jié)果人腦血管母細(xì)胞瘤組織中VEGF和bFGF的表達(dá)顯著高于正常腦組織（P＜0.01），腫瘤組中MVD值（168.7±56.3）高于正常對(duì)照組（24.6±13.4），VEGF與bFGF在人腦血管母細(xì)胞瘤組織中表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.541，P＜0.01）。與囊性和實(shí)性血管母細(xì)胞瘤中VEGF、bFGF和MVD的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論VEGF和bFGF在作用機(jī)制上可能有密切的聯(lián)系或存在因果關(guān)系，檢測(cè)VEGF和bFGF可以為腦血管母細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制研究及臨床治療提供新的思路。抗VEGF及抗bFGF聯(lián)合治療可能成為治療腦血管母細(xì)胞瘤的新方法。

血管母細(xì)胞瘤；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子類；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子

中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管母細(xì)胞瘤（hemangioblastoma，HB）病理形態(tài)上分為實(shí)質(zhì)型和囊變型，其中囊性居多，占總數(shù)的2/3～3/4。近年來(lái)，腫瘤血管生成與血管生長(zhǎng)因子的研究一直是腫瘤病理學(xué)研究中的熱點(diǎn)，對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）的研究較多，提示這2種因子與腫瘤血管的形成有關(guān)，其表達(dá)水平還與腫瘤組織的生物學(xué)行為密切相關(guān)。我們檢測(cè)了32例腦血管母細(xì)胞瘤患者瘤組織標(biāo)本和10例正常腦組織標(biāo)本中VEGF和bFGF水平，并計(jì)數(shù)腫瘤微血管密度（microvessel density，MVD），探討它們的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料：標(biāo)本選自2003年12月—2008年6月河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦血管母細(xì)胞瘤患者32例，男性18例，女性14例，年齡15～68歲，平均（41.7±6.5）歲，其中實(shí)質(zhì)型6例，囊變型26例；另取顱腦損傷后顱內(nèi)減壓手術(shù)中切除的正常腦組織10例為對(duì)照，男性6例，女性4例，年齡16～63歲，平均（39.9±6.3）歲。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

1.2.1 試劑：兔抗人VEGF單克隆抗體、鼠抗人bFGF單克隆抗體、鼠抗人CD34單克隆抗體（均購(gòu)自北京中山生物工程有限公司），S-P試劑盒、對(duì)氨基聯(lián)苯胺顯色劑。

1.2.2 方法：組織標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋，連續(xù)3～4μm厚度切片，按免疫組織化學(xué)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，陰性對(duì)照選擇PBS代替一抗。陽(yáng)性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)，VEGF以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核呈清晰黃色或棕黃色為強(qiáng)陽(yáng)性，bFGF以細(xì)胞核呈清晰黃色或棕黃色為強(qiáng)陽(yáng)性。在高倍（×400）視野下計(jì)算200個(gè)腫瘤細(xì)胞（共計(jì)5個(gè)視野，取其平均值），計(jì)算免疫反應(yīng)陽(yáng)性的細(xì)胞百分比。陰性（-），無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞染色；弱陽(yáng)性（+），陽(yáng)性細(xì)胞＜50％；中度陽(yáng)性（++），陽(yáng)性細(xì)胞≥50％而＜75％；強(qiáng)陽(yáng)性（+++），陽(yáng)性細(xì)胞≥75％。

1.2.3 微血管計(jì)數(shù)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：采用CD34抗體標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，計(jì)算腦血管母細(xì)胞瘤和正常腦組織中MVD，采用Weidner微血管計(jì)數(shù)法在40倍物鏡下選取高密度血管區(qū)，200倍顯微鏡下計(jì)數(shù)3個(gè)視野內(nèi)被CD34染成棕色的血管數(shù)，取其平均值為該標(biāo)本的MVD。

圖1 VEGF在正常腦組織中無(wú)陽(yáng)性表達(dá)（S-P×200）Figure1 The negative expression of VEGF in normal brain tissues（S-P×200）

圖2 VEGF在腦血管母細(xì)胞瘤組織中陽(yáng)性表達(dá)（S-P×200）Figure2 The positive expression of VEGF in hemangioblastomas（S-P×200）

圖3 bFGF在正常腦組織中無(wú)陽(yáng)性表達(dá)（S-P×200）Figure3 The negative expression of bFGF in normal brain tissues（S-P×200）

圖4 bFGF在腦血管母細(xì)胞瘤組織中陽(yáng)性表達(dá)（S-P×200）Figure4 The positive expression of bFGF in hemangioblastomas（S-P×200）

2 結(jié)果

2.1 VEGF和bFGF在腦血管母細(xì)胞瘤和正常腦組織中的表達(dá)：VEGF蛋白陽(yáng)性染色在腦血管母細(xì)胞瘤組織中明顯增高，陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色顆粒狀，彌漫性或灶狀分布，為胞漿、胞膜染色，主要表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞；正常腦組織組切片中VEGF無(wú)表達(dá)（圖1，2）。bFGF蛋白陽(yáng)性染色在腦血管母細(xì)胞瘤組織中明顯增高，其陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色顆粒狀，彌漫分布，表達(dá)以細(xì)胞核為主，主要分布在血管周圍，胞漿呈弱陽(yáng)性；而在正常腦組織組切片中bFGF少許表達(dá)（圖3，4）。腫瘤組織中VEGF、bFGF表達(dá)均明顯高于正常腦組織（χ2=32.813、16.847，P＜0.01）；而VEGF、bFGF在實(shí)性和囊性血管母細(xì)胞瘤中表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.764、1.031，P＞0.05）。見(jiàn)表1，2。

表1 腦血管母細(xì)胞瘤組織與正常腦組織VEGF、bFGF表達(dá)比較Table 1 The expression of VEGF and bFGF in hemangioblastomas and normal brain tissues（n）

表2 VEGF、bFGF在實(shí)性和囊性血管母細(xì)胞瘤中表達(dá)比較Table 2 The expression of VEGF，bFGF in the cystic and solid tumors of hemangioblastomas（n，％）

2.2 腫瘤組織的MVD：光鏡下可見(jiàn)大量微血管彌散性分布，腫瘤血管壁呈棕黃色著色，血管內(nèi)皮細(xì)胞CD34陽(yáng)性表達(dá)。32例腦血管母細(xì)胞瘤組織中MVD均值為（168.7±56.3）個(gè)/單位面積，10例正常腦組織中MVD均值為（24.6±13.4）個(gè)/單位面積，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=36.068，P＜0.01）；在實(shí)性血管母細(xì)胞瘤中MVD均值（172.7±59.3）個(gè)/單位面積，囊性血管母細(xì)胞瘤MVD均值（167.4±55.6）個(gè)/單位面積，2組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.807，P＞0.05）。

2.3 直線相關(guān)分析：VEGF與bFGF在腦血管母細(xì)胞瘤中的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.541，P＜0.01）。

3 討論

腦血管母細(xì)胞瘤是富含大量血管和囊性變組織的血管性腫瘤，腫瘤生長(zhǎng)需要血管生成支持，通過(guò)抑制血管生成的途徑進(jìn)行抗腫瘤治療成為新興的腫瘤治療途徑，目前已對(duì)這種治療進(jìn)行了許多探索，并取得了一定進(jìn)展［1-2］。

VEGF是促進(jìn)腫瘤血管形成、上調(diào)血管生長(zhǎng)的重要因子，也是不可缺少的血管生長(zhǎng)誘導(dǎo)因子，與多種腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，它能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，通過(guò)出芽方式誘導(dǎo)新生血管形成。Peper等［3］發(fā)現(xiàn)在VEGF作用下，血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌膠原酶和血漿酶原活化因子，促進(jìn)細(xì)胞外蛋白水解，內(nèi)皮細(xì)胞可借此穿過(guò)血管下基質(zhì)向腫瘤組織遷移，腫瘤細(xì)胞也可利用這些蛋白酶反方向運(yùn)動(dòng)，從而使腫瘤細(xì)胞更容易侵襲。正常的血管內(nèi)皮細(xì)胞不產(chǎn)生VEGF，小腦血管母細(xì)胞瘤組織中的VEGF主要由瘤組織基質(zhì)細(xì)胞分泌。bFGF是多種細(xì)胞的有絲分裂源，在許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中都有明顯表達(dá)，它的過(guò)表達(dá)與細(xì)胞的惡性增殖密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的bFGF有最具特征性血管生成作用，它能通過(guò)受體與相應(yīng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等靶細(xì)胞結(jié)合發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，并能誘導(dǎo)神經(jīng)中外胚層來(lái)源的細(xì)胞增殖和分化，與血管形成、化學(xué)趨化、損傷修復(fù)、神經(jīng)再生、腫瘤生長(zhǎng)等多項(xiàng)生理病理有關(guān)［4-6］。Abe等［7］在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)與人膠質(zhì)瘤細(xì)胞一同培養(yǎng)的小牛血管內(nèi)皮細(xì)胞可以形成類似的血管結(jié)構(gòu)，一旦培養(yǎng)液中加入抗bFGF抗體，就阻斷了這種血管樣結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，這提示bFGF可能以一種旁分泌方式影響腫瘤新生血管的形成。李愛(ài)冰等［8］臨床研究發(fā)現(xiàn)VEGF、bFGF在血管母細(xì)胞瘤組織中有高表達(dá)。本研究結(jié)果提示，VEGF和bFGF在腦血管母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)均明顯高于正常組織，但在囊性和實(shí)性瘤組織中表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示兩者在血管母細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)過(guò)程中起重要作用，能促進(jìn)更多的新生血管生成，為腫瘤組織提供更多營(yíng)養(yǎng)。

有研究［9］證明VEGF和bFGF在體內(nèi)都有促進(jìn)血管生成的作用，兩者協(xié)同促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，并維持血管結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，VEGF能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌bFGF，bFGF又能夠以自分泌和旁分泌的方式增強(qiáng)自身的血管生成活性［4，10］。Hadari等［11］在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)加入bFGF，可使內(nèi)皮細(xì)胞的VEGF表達(dá)增加，如果阻斷VEGF的表達(dá)，bFGF就不能誘

導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞形成血管，如果抑制bFGF，則VEGF使血管形成的時(shí)間大大推遲。MVD是反映腫瘤微血管生成的客觀指標(biāo)，本研究發(fā)現(xiàn)VEGF和bFGF表達(dá)與新生血管的增殖表現(xiàn)一致，且VEGF與bFGF的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.541，P＜0.01）。提示VEGF和bFGF在誘導(dǎo)腫瘤血管生成的機(jī)制中有明顯協(xié)同作用。

綜上所述，腦血管母細(xì)胞瘤發(fā)生生長(zhǎng)是一個(gè)受基因調(diào)控、細(xì)胞因子作用的復(fù)雜過(guò)程，VEGF、bFGF抗體與腫瘤的密切相關(guān)性已有許多研究報(bào)道，針對(duì)血管因子及其受體的抗腫瘤血管治療已走向臨床，應(yīng)用其及受體單克隆抗體將成為治療腫瘤的一種新途徑。

［1］ 王琪，李嘉姝，程莉莉，等.抗血管生成與腫瘤治療［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2012，9（1）：56-57.

［2］ PETROVICM，ILIC N，BASKIC D.The value of neuroendocrine markers for response to therapy and survival in patients with advanced non-small cell lung cancer［J］.Srp Arh Celok Lek，2010，138（1/2）：37-42.

［3］ PEPER MS，WASIW F，F(xiàn)ERIARA AN，et al.In vitro angiogenic and proteolytic properties of bovine lymphatic endothelial cells［J］.Exp Cell Res，1994，210（2）：298-230.

［4］ KIGEL B，RABINOWICZ N，VARSHAVSKY A，et al.Plexin-A4 promotes tumor progression and tumor angiogenesis by enhancement of VEGF and bFGF signaling［J］.Blood，2011，118（15）：4285-4296.

［5］ POLYKANDRIOTIS E，ARKUDAS A，BEIER JP，et al.The impact of VEGF and bFGF on vascular stereomorphology in the context of angiogenic neoarborisation after vascular induction［J］.Electron Microsc，2011，60（4）：267-274.

［6］ ZHAO M，GAO FH，WANG JY，et al.JAK2/STAT3 signalingpathway activation mediates tumor angiogenesis by upregulation of VEGF and bFGF in non-small-cell lung cancer［J］.Lung Cancer，2011，73（3）：366-374.

［7］ ABE T，OKAMURA K，ONO M，et al.Induction of vascular endothelial tubularmorphogenesie by human glioma cells：amodel system for tumor angiogenesis［J］.JClin Invest，1993，92（6）：54-61.

［8］ 李愛(ài)冰，袁先厚，陳新軍.VEGF、bFGF在血管網(wǎng)織細(xì)胞瘤中的表達(dá)［J］.中華神經(jīng)外科，2002，4（1）：20-23.

［9］ TSUNODA S，NAKAMURA T，SAKURAI H，et al.Fibroblast growth factor induced host stroma reaction during initial tumor growth promotes progression of mouse melanoma via vascular endothelial growth factor A-dependent neovascularization［J］.Cancer Sci，2007，98（4）：541-548.

［10］ DAIH，ZHAO S，XU L，etal.Expression of Efp，VEGF and bFGF in normal，hyperplastic and malignant endometrial tissue［J］.Oncol Rep，2010，23（3）：795-799.

［11］ HADARIYR，KOUHARA H，LAX I，etal.Binding of Shptyrosine phosphatase to FRS2 is essential for fibroblast growth factorinduced PC2 cell differentiation［J］.Mol Cell Biol，1998，18（6）：3966-3973.

（本文編輯：趙麗潔）

EXPRESSION OF VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR，BASIC FIBROBLAST GROW TH FACTOR AND THE CORRELATION W ITH ANGIOGENESIS IN HEMANGIOBLASTOMA

LIU Min1，LISong2，ZHAO Yun1
（1.Department of Rehabilitation，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China；2.Outpatient Department，Ordnance Engineering College，Shijiazhuang 050000，China）

Objective To investigate the expression and clinical significance of vascular endothelial growth factor（VEGF）and basic fibroblast growth factor（bFGF）in hemangioblastoma and the relationship with angiogenesis in tumor.M ethods Streptavidin-Peroxidase（S-P）immunohistochemical technique was applied to examine and analyse the expression of VEGF and bFGF in 32 cases of hemangioblastoma and 10 cases of normal brain tissue.The endothelial cells of blood vessels within the tumor were labeled by CD34，then themicrovessel density（MVD）was calculated.Results The expression of VEGF and bFGF in hemangioblastoma was significantly higher than those in normal brain tissue（P＜0.01）.MVD was significantly higher in hemangioblastoma than that in normal brain tissue（P＜0.01）.There was positive correlation between the expression of VEGF and bFGF（r= 0.541，P＜0.01）.But there was no significant difference between the cystic and solid tumors on the expression level of VEGF，bFGF and MVD（P＞0.05）.Conclusion heremay be a causal relationship between VEGF and bFGF inmechanism.Examination of bFGF and VEGFmay provide a new thought on

hemangioblastoma；vascular endothelial growth factors；fibroblast growth factors

2012-08-27；

2012-09-24

河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計(jì)劃項(xiàng)目（112761154）

劉敏（1978-），女，河北石家莊人，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事臨床康復(fù)研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.01.002

R730.264.4

A

1007-3205（2013）01-0005-04

the pathogenesis and treatment of hemangioblastoma.And anti-VEGF and anti-bFGF therapy would be a new treatment for hemangioblastoma.