紫杉醇脂質體誘導骨肉瘤細胞MG-63凋亡及其機制的研究

張素領，李貴霞，張麗霞，李國慧

（河北省兒童醫院檢驗科，河北石家莊 050031）

紫杉醇脂質體誘導骨肉瘤細胞MG-63凋亡及其機制的研究

張素領，李貴霞*，張麗霞，李國慧

（河北省兒童醫院檢驗科，河北石家莊 050031）

目的探討注射用紫杉醇脂質體對骨肉瘤細胞株的細胞毒作用及其作用機制。方法以0、0.1、1、10、100μg/L濃度梯度的注射用紫杉醇脂質體培養基作用于骨肉瘤細胞株，通過四甲基偶氮唑藍法（methy thiazolyh tetrazdium，MTT），倒置相差顯微鏡觀察細胞形態，流式細胞分析技術檢測細胞凋亡率，蛋白印跡（Western blot）技術分析細胞內增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的表達情況。結果不同濃度藥物作用于細胞48h后，細胞存活率下降；鏡下細胞形態，從梭型趨于圓型，細胞內質聚集，細胞與細胞間距增大，隨著藥物濃度的逐漸加大，胞漿內顆粒也隨之增多，細胞與平皿的附著力減弱，出現不等量的懸浮細胞。流式細胞儀結果顯示隨著藥物濃度的增大，細胞凋亡率隨之增高；Western blot顯示PCNA的表達逐漸降低。結論紫杉醇脂質體可以抑制骨肉瘤細胞株MG-63的生長，其機制可能與PCNA有關。

骨肉瘤；紫杉醇脂質體；細胞凋亡

骨肉瘤是惡性程度很高的骨腫瘤，多發于青少年。由于該疾病對常規放療、化療均不敏感，治療結果往往并不理想，多數患者最終死于腫瘤的復發和轉移。因此，骨肉瘤一直是骨科領域的一個難題。輔助化療技術的臨床普及推廣，使骨肉瘤的5年生存率由20％左右提高到60％，尋找新的對骨肉瘤有效的化療措施和治療策略有著十分重要的臨床意

義。紫杉醇（paclitaxel）是一種抗癌機制獨特的最熱點的新型抗腫瘤藥物，其能促進小管蛋白聚合為微管，這類微管不同于一般微管在有絲分裂后能解聚重新生成小管蛋白，而是一種對熱和鈣穩定的微管，不會發生正常的生理性解聚，從而防止細胞進一步有絲分裂，導致腫瘤細胞的凋亡。紫杉醇由于獨特的療效是目前臨床化療藥物的一線用藥，主要障礙是不溶于乙醇、水，只有在聚氧乙烯基蓖麻油中溶解，因此不良反應較多［1］。紫杉醇脂質體（力撲素）是用卵磷脂等將紫杉醇進行包裹，去除了原來的溶媒。文獻［2］報道紫杉醇脂質體與紫杉醇注射液有相似效果。而紫杉醇脂質體是改良的不良反應較小的藥物，紫杉醇脂質體對于骨腫瘤的作用國內外尚未見報道。本研究將紫杉醇脂質體作用于骨肉瘤細胞，旨在為骨肉瘤的輔助化療方案提供一種新的思路，為臨床藥物的應用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品：注射用紫杉醇脂質體（力撲素）為南京思科藥業有限公司提供，產品批號為070606。紫杉醇脂質體用5％葡萄糖注射液10mL稀釋，振搖5 min充分混勻后使用。細胞培養基（DMEM）購自Gibco；胎牛血清購自杭州四季青；胰蛋白酶購自Sigma；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）均為北京化工廠產品；四甲基偶氮唑藍（methy thiazolyl tetrazdium，MTT），Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司；細胞內增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）（鼠抗人多克隆抗體）和內參均購自Santa；辣根酶標記的山羊抗兔IgG（H+L）購自中杉金橋；預染Marker購自Solarbo；增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒購自TianGen。

1.2 細胞培養：MG-63細胞株由河北醫科大學第三醫院實驗中心保存。骨肉瘤MG-63細胞株復蘇，接種到75cm2培養瓶中，加入5mL含有青霉素100U/mL、鏈霉素100g/mL的10％胎牛血清的DMEM培養基中，將培養瓶置于37℃、5％CO2飽和濕度的孵箱中培養，隔天換液，待細胞生長到90％匯合時可傳代。

1.3 MTT試驗：取對數生長期MG-63細胞經胰酶消化后，調整細胞濃度為1×104/mL，每孔200μL接種于96孔板，培養4h后加入20μL的不同濃度藥物，分別設對照組（不加藥培養基）和不同濃度藥物組，每組設5個復孔。分別培養24、48、72h，培養結束前4h吸棄96孔板中的培養基，每孔加入100μL的DMEM+20μL的MTT（5g/L），37℃繼續培養4h后，棄每孔內的培養液，每孔加入100μL的DMSO，再振蕩10min，用全自動酶標儀（測定波長492nm，參考波長630nm）測定各孔吸光度（absorbance，A），全部試驗重復3次，取其平均值。細胞生長抑制率（％）=（1-A試驗/A對照）×100％。

1.4 細胞形態的觀察：采用相差顯微鏡分別觀察對照組及各濃度紫杉醇脂質體組作用MG-63細胞培養48 h后的細胞形態。

1.5 細胞凋亡檢測：采用不同濃度的紫杉醇脂質體，藥物作用48h，收集試驗組細胞和對照組細胞，調整細胞濃度為1×106個/mL，加入1mL冷PBS洗滌2次，分別加入FITC標記的膜聯蛋白（Annexin-V）和碘化丙啶（操作按說明書進行），避光室溫反應15min，用Epic-XLⅣ型流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.6 PCNA蛋白表達檢測：收集上述處理的細胞和對照組細胞，裂解細胞提取蛋白，紫外分光光度計測提取的蛋白濃度，取100μg蛋白上十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate polyacrylamidegel electropheresis，SDS-PAGE）凝膠電泳，轉膜到PVDF膜上，考馬斯亮藍凝膠染色以檢測蛋白質的轉移情況。轉膜后，用封閉液封閉1h，鼠抗的PCNA（1∶200），鼠抗內參（1∶600）4℃過夜。洗膜3次，抗鼠的IgG（1∶1 000）振蕩孵育1h，洗膜3次，DAB顯色，密度掃描分析采用美國Kodak公司ID數碼成像分析系統軟件對蛋白印跡（Western blot）結果進行定量分析，灰度值以積分光密度值（integrated bptica desity，IOD）表示，重復上述實驗3次，取其均值。

2 結果

2.1 紫杉醇脂質體抑制骨肉瘤細胞的生長：選用不同濃度的紫杉醇脂質體處理MG-63細胞24、48、72h，MTT結果顯示各濃度紫杉醇脂質體對細胞的生長均有抑制作用。作用72h的各個濃度組與對照組比較，紫杉醇脂質體對MG-63細胞的生長抑制作用差異有統計學意義（P＜0.05），且隨著紫杉醇脂質體濃度的增加抑制率也隨之增加，顯示了良好的劑量-效應關系。相同濃度的紫杉醇脂質體組作用時間越長抑制率越高，顯示了良好的時間-效應關系。見表1。

表1 不同濃度紫杉醇脂質體對MG-63的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of different concentrations of paclitaxel liposome on the grow th of MG-63 in vitro

2.2 紫杉醇脂質體誘導MG-63細胞凋亡的形態學變化：倒置顯微鏡下觀察，紫杉醇脂質體對MG-63細胞隨著藥物濃度的增加、作用時間的延長，細胞生長顯示出明顯抑制作用，將紫杉醇脂質體藥物濃度按不同濃度（0.1、1、10、100μg/L）作用于MG-63細胞，48h后倒置顯微鏡可見細胞胞體變圓，細胞附壁能力減弱，部分細胞脫離培養板，懸浮于液體中。少數細胞可見膜破裂核質脫落呈壞狀結構，且高濃度組比低濃度組細胞生長受抑制更明顯。對照組細胞形態生長正常，細胞增殖狀態良好（圖1）。

2.3 流式細胞儀的分析結果：經不同濃度的紫杉醇脂質體處理MG-63細胞48h后，細胞凋亡率逐漸增加，與對照組相比較，差異有統計學意義。提示紫杉醇脂質體可抑制MG-63細胞的增殖（圖2）。

2.4 Western blot結果分析：MG-63細胞經不同濃度的紫杉醇脂質體處理48h后，PCNA蛋白表達逐漸減弱，提示該藥物抑制了PCNA分泌量及活性，促使骨肉瘤細胞趨向凋亡，因此證實了兩者之間存在著一定的相關性（圖3）。

3 討論

紫杉醇是一種具有結構獨特和作用高效的廣譜抗腫瘤藥，對多種腫瘤療效顯著［3-4］。但由于其溶媒問題，可導致不同程度的過敏反應。脂質體可作為藥物的載體，特別是作為抗腫瘤藥物的新劑型，它具有減少藥物劑量，降低毒性，減輕變態反應和免疫反應等作用，還具有提高藥物療效的功能。注射用紫杉醇脂質體（力撲素）利用卵磷脂等將紫杉醇進行包裹，去除了原來的溶媒，具有改善藥物的溶解性、延長藥物的半衰期、提高藥物靶向性和降低藥物不良反應等優點［5］。骨肉瘤是骨原發性的惡性腫瘤，好發于青少年。該病常在早期發生肺轉移，是骨科領域的一個難題。近年來，骨肉瘤保肢治療逐漸取代截肢術［6］。在骨肉瘤的綜合治療中，控制肺轉移率，提高患者的長期生存率，化療占據了極其重要的地位。尋找新的更有效的且毒性低的化療藥物治療骨肉瘤，以挽救更多的生命有著十分重要的臨床意義。

目前已知，紫杉醇類藥物能夠使微管蛋白二聚體裝配成微管，抑制細胞的有絲分裂，誘導細胞死亡，從而抑制腫瘤細胞增殖。研究［7］還發現，紫杉醇抗腫瘤作用機制除了與抗微管作用有關以外，還與誘發細胞凋亡有關。本研究對MG-63細胞的流式細胞術的檢測結果證實了這一點，并與文獻報道的紫杉醇誘導U-2OS細胞的研究結果一致［8］。本研究結果證實紫杉醇脂質體對骨肉瘤細胞有抑制作用，并表現了一定的濃度和時間依賴性。PCNA是反映細胞增殖狀態的良好指標。PCNA在腫瘤細胞中高表達，在S期達高峰，其量的變化與DNA合成一致，其合成表達與細胞增殖周期密切相關，并可作為腫瘤惡性程度的參考指標。本研究中PCNA在不同藥物組中表達與對照組相比較明顯下降，表明紫杉醇脂質體對骨肉瘤細胞株抑制增殖作用明顯［9-10］?，F在一線化療藥物出現了一些耐藥現象，二線藥物紫杉醇越來越受到人們的青睞。紫杉醇脂質體更以其高效的抑瘤作用、不良反應小而備受關注。紫杉醇脂質體由于生產成本較高，價格昂貴，限制了其臨床推廣。

我們相信隨著科學的發展，研究者們會生產出更好的紫杉醇脂質體，使其成為治療骨肉瘤的重要手段之一。（本文圖見封三）

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THE STUDY OF INDUCTIVE APOTOSIS BY PACLITAXEL LIPOSOM E IN OSTEOSARCOMA MG-63 CELLS AND ITSMECHANISM

ZHANG Suling，LIGuixia*，ZHANG Lixia，LIGuohui
（Depatment of Clinical Laboratory，the Children's Hospital of Hebei Province，Shijiazhuang 050031，China）

Objective To explore the cytotoxic effects and mechanism of injectable paclitaxel liposome on osteosarcoma cells.M ethods Human osteosarcoma cells were treated with the cell culture medium which contained injecting paclitaxel liposome with concentration of 0，0.1，1，10，100μg/L，methyl thizolyl tetrazdium（MTT）and phase-contrastmicroscopewere used to observe themorphology of the cells，flow cytometry was applied to determine the percentage of apoptosis of osteosarcoma MG-63 cells.The expression of proliferating cell nuclear antigen（PCNA）was detected by Western blot.Results

osteosarcoma；paclitaxel liposome；apoptosis

R783.1

A

1007-3205（2013）01-0040-04

2012-06-24；

2012-09-17

張素領（1981-），女，河北藁城人，河北省兒童醫院醫師，醫學碩士，從事臨床檢驗診斷研究。

*通訊作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.01.016

After being treated by paclitaxel liposome of the above concentrations for 48h，cell survival rate decreased；Microscopically the cells changed from spindle to round，the endosarc of cells assembled，the space between cells increased.With the gradually increasing of drug concentration，the cytoplasm particles increased，the adhesion between the cells and culture dish weakened，some suspended cells appeared.Flow cytometry showed that with the increasing of concentration cell apoptosis rate increased gradually.The expression of PCNA decreased.Conclusion Paclitaxel liposome can inhibit the growth of osteosarcoma cells.Themechanism of apoptosis induction maybe associated with PCNA protein.