外源性八肽膽囊收縮素對嗎啡所致SH-SY5Y和PC12細胞毒的保護作用

李 冬，孟雁欣，楊勝昌，文 迪，叢 斌，馬春玲

（河北醫科大學基礎醫學院法醫學系，河北省法醫學重點實驗室，河北石家莊050017）

外源性八肽膽囊收縮素對嗎啡所致SH-SY5Y和PC12細胞毒的保護作用

李 冬，孟雁欣，楊勝昌，文 迪，叢 斌，馬春玲*

（河北醫科大學基礎醫學院法醫學系，河北省法醫學重點實驗室，河北石家莊050017）

目的觀察外源性八肽膽囊收縮素（cholecystokinin octapeptide，CCK-8）對嗎啡處理SH-SY5Y及PC12細胞毒性作用的影響。方法應用二甲基噻唑二苯基四噻唑鹽［3-（4，5）-dimethylthiazo（-2-yl）-3，5-diphenytetrazoliumromide，MTT］法觀察嗎啡對SH-SY5Y及PC12細胞毒性作用的劑量和時間依賴關系，并且觀測外源性CCK-8對嗎啡細胞毒性作用的影響。結果①嗎啡在100～10 000μmol/L濃度范圍內顯著降低SH-SY5Y和PC12細胞的生存率，半數抑制率分別為2 520μmol/L和680μmol/L；上述作用在孵育48h明顯，隨時間延長逐漸增強；CCK-8（10-6和10-8mol/L）可明顯抑制3 000μmol/L嗎啡作用48h后SH-SY5Y細胞生存率的下降，CCK-8（10-6、10-8和10-10mol/L）可明顯抑制1 000μmol/L嗎啡作用48h后PC12細胞生存率的下降；②3 000μmol/L和1 000μmol/L嗎啡分別處理SH-SY5Y細胞和PC12細胞48h后，可見細胞胞體變圓，突觸變短或消失，失去原有的細胞形態。CCK-8（10-6和10-8mol/L）可明顯改善嗎啡作用后SH-SY5Y和PC12細胞的形態改變。結論外源性CCK-8可濃度依賴地對抗嗎啡產生的細胞毒性作用。

受體，膽囊收縮素；嗎啡；法醫毒理學

嗎啡成癮被認為是一種慢性復發性腦病，長期研究［1］表明其與嗎啡導致的神經元毒性密切相關。嗎啡的神經毒性及其機制的研究日漸引起廣泛關注，有研究［2］表明嗎啡可抑制細胞增殖，誘導神經元凋亡，并且在體模型也顯示嗎啡可導致不同腦區神經元出現相應的病理學改變。長期應用阿片類物質可引起體內抗阿片物質的釋放來維持體內的平衡狀態，八肽膽囊收縮素（cholecystokinin octapeptide，CCK-8）作為目前已知最強的內源性抗阿片肽，已被證實在嗎啡鎮痛耐受和成癮過程中具有重要的拮抗作用［3］。本室以往研究也顯示CCK-8在嗎啡依賴和戒斷中發揮了重要的作用［4］。本課題在體外培養SH-SY5Y和PC12細胞的基礎上，采用二甲基噻唑二苯基四噻唑鹽［3-（4，5）-dimethy lthiazo（-2-yl）-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT］法觀察了嗎啡細胞毒性及不同濃度CCK-8對其的影響，為探討嗎啡的神經毒性和CCK-8的神經保護作用提供細胞學證據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器：PC12細胞系（上海細胞生物學研究所細胞庫），SH-SY5Y細胞系（上海拜力生物科技有限公司）；DMEM F12及RPMI培養基（美國Gibco公司），胎牛血清（英國PAA公司）；鹽酸嗎啡注射液（沈陽第一制藥廠），CCK-8（美國Sigma公司），MTT（美國Sigma公司）；酶標儀（美國Molecular Devices公司），細胞自動計數儀（美國Invitrogen公司），Olympus光學顯微鏡。

1.2 SH-SY5Y以及PC12細胞的培養：SH-SY5Y細胞接種于含有10％的胎牛血清、100U/mL青、鏈霉素的DMEM F12培養基中，PC12細胞接種于含有10％的胎牛血清、100U/mL青、鏈霉素的RPMI培養基中，37℃下持續通入5％CO2和95％空氣培養。

SH-SY5Y和PC12細胞均呈貼壁生長狀態，50mL培養瓶底貼壁密度達70％～80％時，取對數生長期的細胞，以1×105/mL密度接種于96孔板，100μL/孔。過夜孵育培養使細胞進入G0期后給予藥物干預。

1.3 MTT法檢測細胞生存率：MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為不溶于水的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。分別于各組作用結束前4h加入10μL/孔MTT，4h后再加入150μL/孔，10％SDS終止反應，孵育過夜，待顆粒溶解后以酶標儀（570nm）測定各孔光密度值（optical density，OD）。細胞生存率=檢測組OD/對照組OD×100％。

1.4 實驗設計

1.4.1 不同濃度嗎啡對細胞生存率影響：嗎啡工作液依次10倍比稀釋為0.1～10 000μmol/L，作用48h，每個濃度設立6個副孔。計算其半數抑制率（halfmaximal inhibitory concentration，IC50）值，觀測嗎啡作用的濃度依賴性，以篩選嗎啡作用濃度。

1.4.2 嗎啡作用不同時間對細胞生存率的影響：根據篩選得到的嗎啡濃度，分別作用不同時間點，3、6、12、24、48、96h，觀測嗎啡作用的時間依賴性。

1.4.3 CCK-8對嗎啡作用的影響：CCK-8依次100倍稀釋為10-6～10-12mol/L，作用48h，觀察單獨CCK-8對SH-SY5Y細胞和PC12細胞生存率的影響。并且在嗎啡作用前15min加入不同濃度的CCK-8，以觀測CCK-8對嗎啡處理2種細胞生存率的影響。

2 結果

2.1 不同濃度嗎啡對SH-SY5Y及PC12細胞生存率的影響：嗎啡作用于SH-SY5Y和PC12細胞48h，細胞生存率隨濃度增加而逐漸下降，顯示出明顯的濃度依賴性。對于SH-SY5Y細胞，0.1～100μmol/L嗎啡對細胞生存率無明顯影響（P＞0.05），1 000μmol/L嗎啡作用48h后細胞生存率降低了24.8％，而10 000μmol/L作用細胞48h后，細胞生存率僅為2.2％，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.01）。對于PC12細胞，0.1～10μmol/L嗎啡對細胞生存率無明顯影響（P＞0.05），100～

1 000μmol/L嗎啡可濃度依賴地抑制PC12細胞的生存率，與對照組相比均明顯下降（P＜0.01）（圖1）。同時我們通過計算求得嗎啡對SH-SY5Y及PC12的IC50分別為2 520μmol/L和680μmol/L，因此我們篩選嗎啡濃度分別為3 000μmol/L及1 000μmol/L對SH-SY5Y及PC12細胞進行下一步的實驗。

2.2 嗎啡作用不同時間對SH-SY5Y及PC12細胞生存率的影響：3 000μmol/L及1 000μmol/L嗎啡分別作用于SH-SY5Y及PC12細胞3、6、12、24、48、96h。隨著嗎啡作用時間的增加，2種細胞的生存率逐漸下降，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.01），顯示出明顯的時間依賴性。見表2。

2.3 CCK-8對嗎啡作用SH-SY5Y及PC12細胞的影響：單獨10-6、10-8、10-10以及10-12mol/L CCK-8分別作用于SH-SY5Y和PC12細胞48h，細胞生存率與對照組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。對于SH-SY5Y細胞，10-6和10-8mol/L的CCK-8可明顯升高3 000μmol/L嗎啡處理SH-SY5Y細胞48h后的細胞生存率（P＜0.01），而10-10以及10-12mol/L的CCK-8無明顯作用（P＞0.05）。對于PC12細胞，10-6、10-8和10-10mol/L的CCK-8可明顯升高1 000μmol/L嗎啡作用48h的細胞生存率（P＜0.01），而10-12mol/L的CCK-8則無明顯影響（P＞0.05）。見圖3，4。

2.4 嗎啡對SH-SY5Y及PC12細胞形態的影響及CCK-8對其的改善作用：3 000μmol/L和1 000μmol/L嗎啡分別處理SH-SY5Y細胞和PC12細胞48h后，可見細胞胞體變圓，突觸變短或消失，失去原有的細胞形態。CCK-8（10-6和10-8mol/L）可明顯改善嗎啡作用后細胞的形態改變，可見細胞胞體長梭形，存在細長突觸，呈現了較為正常的細胞形態（與對照組相比），10-10和10-12mol/L的CCK-8則無明顯作用。見圖5。

3 討論

自從嗎啡被提取純化之后，強大、長效的鎮痛作用使其被廣泛應用于臨床，然而嗎啡的神經毒性近幾十年才被關注。雖然對嗎啡鎮痛作用及其機制有被深入研究，但對其神經毒性的探討仍留有很多難點、疑點。嗎啡濫用引發的社會、健康問題日益凸顯，嗎啡的神經毒性在其成癮機制中發揮了什么作用？對神經細胞的影響究竟基于怎樣的分子通路？都有待于我們進一步研究。本室以往研究發現CCK-8可減緩嗎啡依賴并減輕嗎啡戒斷癥狀［4］。CCK-8屬于小分子肽類物質，參與調節中樞神經、內分泌、免疫等多系統機能活動，CCK-8通過與其受體結合發揮拮抗嗎啡的作用。目前，CCK-8的神經保護作用機制尚不明確，其對嗎啡神經毒性的作用尚未見報道。

SH-SY5Y和PC12細胞株分別來源于人神經母細胞瘤和大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤，在細胞形態、生理、生化等功能上與正常的神經細胞相似，是神經細胞研究比較理想的細胞模型［5］。研究［6］發現，由于個體耐受性不同嗎啡致死量存在較大差別，嗎啡成癮者對嗎啡有極強的耐受性，可耐受正常量的35～40倍，約70μmol/L，而不發生中毒，根據本次研究的結果，嗎啡成癮者體內的嗎啡濃度對神經細胞的生存率已產生影響，達到細胞毒水平。本研究發現：①3 000μmol/L嗎啡作用于SH-SY5Y細胞48h后可導致其細胞形態發生明顯改變，表現為細胞胞體變圓，突觸變短或消失。MTT結果也顯示，嗎啡可濃度和時間依賴地抑制SH-SY5Y細胞的生存率，與以往文獻報道一致。SH-SY5Y細胞主要表達μ阿片受體。以往研究對嗎啡導致SH-SY5Y細胞的增殖抑制和凋亡的機制研究較為明確，μ阿片受體在細胞介導信號轉導、ROS產生、caspase級聯反應中起重要作用。嗎啡可能通過作用于SH-SY5Y細胞表面的μ阿片體誘導細胞內ROS的產生［7］，通過氧化還原修飾影響細胞信號傳導系統進而誘導細胞的凋亡。②1mmol/L嗎啡作用于PC12細胞48h后可導致其細胞形態出現類似于SH-SY5Y細胞的改變。MTT結果也同樣顯示，嗎啡可濃度和時間依賴的抑制PC12細胞的生存率。PC12細胞表面主要表達κ受體。以往也有研究報道嗎啡可與κ受體結合，通過調節細胞外調節蛋白激酶和C-Jun氨基末端激酶信號通路而影響細胞的活性［8-9］。

然而嗎啡對SH-SY5Y細胞和PC12細胞IC50的不同提示受體類型與嗎啡對細胞的活性影響的差異可能存在一定的相關性。已知嗎啡對μ阿片受體的親和力遠高于κ受體，而本研究得到的結果卻顯示PC12細胞對嗎啡細胞毒性表現出較SH-SY5Y細胞更高的敏感性，我們推測存在除受體以外多種因素共同參與了嗎啡的神經毒性作用。

本室以往研究發現，外源性CCK-8可減緩嗎啡依賴并減輕嗎啡戒斷癥狀［4］。近期研究發現CCK-8可濃度依賴的抑制谷氨酸引起的細胞損傷或死

亡［10］。選擇性CCK2受體拮抗劑L-365，260可以完全阻斷CCK-8類似物藍肽保護作用，提示CCK2受體可能介導了CCK-8對抗谷氨酸的毒性作用。也有研究［11］顯示CCK-8、CCK-8類似物藍肽、CCK-8NS可以通過作用于CCK2受體抑制N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-asportic acid，NMDA）受體介導的谷氨酸對大鼠大腦皮層神經元的毒性作用；CCK-8在體內及體外均能明顯改善谷氨酸所致的神經元病理損害；谷氨酸激活NMDA受體后促進Ca2+內流，Ca2+與鈣調素結合激活一氧化氮合酶，進而生成大量一氧化氮引起細胞損傷［12］。對培養的神經細胞的研究［13］發現，膽囊收縮素對NMDA受體激活引起的Ca2+內流無影響，但可通過胞內某種信號轉導系統抑制Ca2+與鈣調素的結合而減少一氧化氮合成，發揮拮抗谷氨酸的神經毒性作用。

本研究發現CCK-8可濃度依賴地抑制嗎啡誘導的SH-SY5Y細胞和PC12細胞生存率的下降，改善細胞形態。雖然嗎啡神經毒性的細胞機制尚未完全明確，但其最終都是通過細胞內信號轉導途徑誘導細胞的增殖抑制或凋亡。研究［14］發現，嗎啡可通過對核因子-κB的直接抑制以及降低腫瘤壞死因子-α的表達和釋放，在體外誘導許多癌細胞系的凋亡。CCK-8可通過激活腺苷-3'，5-環化-磷酸-蛋白激酶A通路，抑制蛋白激酶通路進而抑制大鼠肺組織及大鼠肺間質巨噬細胞內核因子-κB的活性［15］，或通過其他途徑抑制蛋白激酶C而降低核因子-κB的活性［16］。目前CCK-8發揮神經保護的作用機制仍不明確，對于CCK-8是通過影響嗎啡誘導的細胞增殖抑制還是細胞凋亡進而發揮其神經保護作用，仍有待我們進一步探索。（本文圖見封二）

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（本文編輯：劉斯靜）

CCK-8 PROTECTSMORPHINE-INDUCED CYTOTOXICITY IN SH-SY5Y AND PC12 CELLS

LIDong，MENG Yanxin，YANG Shengchang，WEN Di，CONG Bin，MA Chunling*Department of Forensic Medicine，the School of Basic Medical Sciences，Hebei Medical University；
Hebei Key Laboratory of Forensic Medicine，Shijiazhuang 050017，China）

Objective To explore the effect of exogenous cholecystokinin octapeptide（CCK-8）on morphine-induced cytotoxicity.M ethods 3-（4，5）-dimethy lthiazo（-2-yl）-3，5-diphenytetrazoliumromide（MTT）assay was used to assess the dose-and time-dependent response of morphine-induced cytotoxicity in SH-SY5Y and PC12 cells，also the effectof CCK-8 onmorphine-induced cytotoxicity was observed.Results ①The concentration of morphine was from 100μmol/L to 10 000μmol/L which reduced the survival rate of SH-SY5Y and PC12 cells significantly.And the half maximal inhibitory concentration was 2 520μmol/L and 680μmol/L respectively，meanwhile this role became obviously after 48h and then gradually increased with time.CCK-8（10-6and 10-8mol/L）could obviously inhibit the effect ofmorphine on the survival rate of SH-SY5Y cells，while CCK-8（10-6，10-8and 10-10mol/L）could obviously inhibit the effectofmorphine on PC12 cells.②After treating SH-SY5Y cells and PC12 cellswith 3 000μmol/L and 1 000μmol/Lmorphine separately for 48 hours，both of the cells lost their normal shape with synapse shorten or lost，CCK-8（10-6and 10-8mol/L）could

receptors，cholecystokinin；morphine；forensic toxicology

R894.2

A

1007-3205（2013）01-0001-04

2012-09-12；

2012-10-22

國家自然科學基金（30672355，81172900）；河北省應用基礎研究重點基礎研究項目（10966911D）

李冬（1984-），女，滿族，河北石家莊人，河北醫科大學基礎醫學院醫學碩士研究生，從事物質成癮研究。

*通訊作者。E-mail：chunlingma@126.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.01.001

significantly improve cellmorphological alternation induced bymorphine.Conclusion Exogenous CCK-8 could inhibitmorphine-induced cytotoxicity in a concentration-dependentway.