Gax基因對低氧性肺動脈內皮細胞增殖、凋亡和周期的影響

夏世金 吳俊珍 孫濤 胡明冬 錢桂生

·論 著·

Gax基因對低氧性肺動脈內皮細胞增殖、凋亡和周期的影響

夏世金 吳俊珍 孫濤 胡明冬 錢桂生

目的觀察Gax基因對低氧性肺動脈內皮細胞（PAECs）增殖、凋亡和周期的影響。方法PAECs分為4組：未轉染常氧對照組（常氧組）、未轉染低氧處理組（低氧組）、Ad?βGal轉染后低氧處理組（Ad?βGal＋低氧組）、Ad?Gax轉染后低氧處理組（Ad?Gax＋低氧組）。在常氧和低氧處理1、3、6 h和12 h后，3H?TdR摻入法測PAECs增殖、流式細胞術測細胞周期和凋亡率。結果與常氧組比較，低氧組和Ad?βGal＋低氧組PAECs3H?TdR摻入量均顯著升高（P均＜0.01），低氧6 h最大；Ad?Gax＋低氧組與常氧組比較均顯著升高（P均＜0.01），與低氧組比較均明顯降低（P＜0.01或P＜0.05），低氧6 h降幅最大。與常氧組比較，Ad?βGal＋低氧組和低氧組PAECs凋亡率均顯著降低（P均＜0.05），低氧6 h最低。Ad?Gax＋低氧組與常氧組比較均顯著上升（P＜0.01或P＜0.05），與低氧組比較均明顯增加（P＜0.01或P＜0.05），低氧6 h增幅最大。與常氧組比較，低氧組和Ad?βGal＋低氧組G0/G1期比例明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），低氧6 h最低；S期和G2/M期比例顯著增加（P＜0.05或P＜0.01），低氧6 h S期比例最大。與常氧組和低氧組比較，Ad?Gax＋低氧組G0/G1期比例均顯著上升（P＜0.05或P＜0.01），低氧6 h增幅最大；S期和G2/M期比例顯著降低（P＜0.01或P＜0.05），低氧6 h降幅最高。結論

Gax基因；低氧；肺動脈高壓；內皮細胞；增殖；凋亡；細胞周期

低氧性肺動脈高壓（HPH）對人的長期嚴重危害依然存在。HPH是一治療極為棘手、高致死率和致殘率的病理生理綜合征［1］，在老年人中多發。肺內皮細胞和平滑肌細胞是組成肺血管壁最重要的細胞，低氧時這兩種細胞結構與功能異常是HPH形成的主要病理生理機制。前期研究發現，低氧下調大鼠肺動脈內源性生長終止特異性同源盒基因Gax轉錄和蛋白表達，而大鼠經氣道轉染攜帶Gax基因的重組腺病毒載體（Ad?Gax），發現Gax基因在大鼠肺動脈平滑肌細胞（PASMCs）和肺動脈內皮細胞（PAECs）中均過表達，并能預防低氧誘導大鼠HPH的發生［2］；Ad?Gax轉染抑制低氧性PASMC異常增殖［2］、誘導細胞凋亡［3］、使細胞 G0/G1比例顯著升高、S＋G2/M比例顯著降低［4］。但是，Gax基因對PAECs增殖、凋亡和周期有何影響目前尚不清楚。因此，本實驗通過Ad?Gax轉染體外培養的大鼠PAECs，觀察Gax基因過表達對低氧性PAECs增殖、凋亡和細胞周期的影響，為進一步研究Gax基因調節HPH的作用與機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑 健康成年雄性Sprague?Dawley大鼠，購自復旦大學實驗動物中心；攜帶大鼠Gax基因的重組腺病毒Ad?Gax載體和攜帶大鼠LacZ基因的重組腺病毒Ad?βGal載體（由美國波士頓大學Kenneth Walsh博士惠贈）；高糖細胞培養基（DMEM，Gibco，USA）、0.25％胰蛋白酶（Gibco，USA）、胎牛血清（FBS，Gibco，USA）、細胞培養板和培養瓶（Coming，USA）、二甲基亞砜（DMSO，Sigma）；自動常壓缺氧孵箱（德國賀氏公司）；氚標記胸腺嘧啶核苷（3H?TdR，上海原子能研究所）；β液閃計數儀（Beckmen）。其余試劑為國產分析純。

1.2 PAEC的培養、鑒定與低氧處理 取150～200 g成年健康SD大鼠共40只，隨機分為4組，每組10只。10％烏拉坦腹腔注射麻醉，無菌取大鼠肺動脈，放入含有100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素PBS平皿，將血管外脂肪組織分離沖洗干凈，用細絲線扎住一端血管，用鑷子輕輕夾住結扎的血管末端，再用一根鐵絲將扎住的末端捅進血管，將血管翻過來，使內皮細胞面朝外，扎住另一端。將血管放入盛有0.1％膠原酶的離心管內，37℃消化15 min，震蕩使細胞脫落，離心，洗滌后用DMEM培養液加入10％FBS于10 cm培養皿內培養，細胞生長融合后，用0.25％胰蛋白酶消化傳代。將細胞貼于蓋玻片上，以1％的多聚甲醛固定5 min，免疫細胞化學染色檢查抗Ⅷ因子相關抗原抗體陽性染色和形態學鑒定細胞。3～5代細胞用于本實驗。將細胞放置于自動常壓缺氧孵箱中低氧處理。待細胞長至瓶底的70％～80％，換含0.4％胎牛血清DMEM培養基使PASMCs同步生長48 h。在常氧（21％O2）和低氧（2.5％O2）處理后在各觀察時間點檢測指標。

1.3 實驗分組與基因轉染 PAECs分為4組：未轉染常氧對照組（常氧組）、未轉染低氧處理組（低氧組）、Ad?βGal轉染再行低氧處理組（Ad?βGal＋低氧組）、Ad?Gax轉染再行低氧處理組（Ad?Gax＋低氧組）。分別在常氧和低氧處理1 h、3 h、6 h和12 h各時間點檢測相應指標。Ad?Gax和Ad?βGal經擴增、鑒定、純化后用于實驗［2］。待細胞長至80％或接近完全融合成片時，培養24 h后棄培養液，然后吸出培養液，加入感染復數為80的Ad?Gax轉染液，在37℃、5％CO2細胞孵箱培養1 h后棄轉染液。未轉染組不加Ad?Gax或Ad?βGal轉染液，其余同轉染組。

1.43H?胸腺嘧啶核苷（3H?TdR）摻入法檢測細胞增殖 調整細胞濃度為1×105/ml。分別取各組細胞1 ml接種于96孔培養板，每組每個實驗條件設3個重復孔。37℃、5％CO2培養24 h后，每孔加入37 kBq3H?TdR，再培養6 h后棄培養基，PBS液終止摻入，加入0.25％胰酶消化細胞，收集細胞于玻璃纖維紙上，生理鹽水沖洗3次，用10％三氯乙酸（TCA）固定，無水乙醇脫色，80℃干烤30 min，濾膜烘干后置于閃爍瓶中加入閃爍液，用液體閃爍計數儀測定每分鐘脈沖數（count perminute，CPM）值。實驗重復3次。

1.5 流式細胞術檢測細胞周期和凋亡率 取對數生長期的單層細胞，0.25％胰酶消化，待細胞變圓有脫落趨勢時，立即豎起培養瓶，棄去胰酶。加入3～4 ml無鈣、鎂離子的PBS，用吸管反復吹打使成單細胞懸液。單細胞懸液用70％的冷乙醇固定后，調整細胞濃度為109個/ml；取1 ml細胞懸液，用PBS離心洗2次；棄上清后余下約0.5 ml，加入RNA酶A（每樣品約3000活性單位），37℃孵育30 min；冰浴停止RNA酶作用；加入1.5 ml PI染料（50μg/ml，4℃避光孵育30 min；在流式細胞儀上進行檢測。實驗重復3次。

2 結果

2.1 PAEC的生長與鑒定 細胞培養2 h后可見細胞貼壁。過夜后貼壁細胞明顯增多。早期呈多角形或梭形，形成致密的單層細胞時，呈“鋪路石”狀排列。Ⅷ因子相關抗原免疫細胞化學染色，可見胞漿呈陽性，胞核呈陰性，證明所培養的細胞為PAECs。

2.2 Ad?Gax基因轉染對PAECs中CPM值的影響 與常氧組同時點相比較，低氧組PAECs的3H?TdR摻入量均顯著升高（P均＜0.01），在低氧1～6 h，低氧組PAECs的3H?TdR摻入量漸增，6 h最大，低氧12、24 h緩慢下降；與常氧組同時相比較，Ad?βGal＋低氧組PAECs的3H?TdR摻入量均顯著升高（P均＜0.01），但與低氧組比較無統計學差異（P均＞0.05）；與常氧組同時點相比較，Ad?Gax＋低氧組PAECs的3H?TdR摻入量均顯著升高（P均＜0.01），但與低氧組比較，3H?TdR摻入量均明顯降低（P＜0.01或P＜0.05），低氧1～6 h降幅漸增，6 h時降幅最大，低氧12、24 h降幅減小。見表1。

2.3 Ad?Gax基因轉染對PAECs凋亡率的影響 與常氧組同時點相比較，低氧組和 Ad?βGal＋低氧組PAECs凋亡率均明顯降低（P均＜0.05），低氧1、3 h，低氧組PAECs的凋亡率漸降，低氧6 h最低，低氧12、24 h緩慢上升；與常氧組同時點相比較，Ad?Gax＋低氧組 PAECs凋亡率均顯著上升（P＜0.01或P＜0.05），與低氧組比較，凋亡率也均明顯增加（P＜0.01或P＜0.05），低氧1～6 h增幅漸大，6 h時增幅最大，低氧12、24 h增幅漸減。見表2。

表1 在各種條件下PAECs3H?TdR摻入量CPM值比較（±s，n＝3）

表1 在各種條件下PAECs3H?TdR摻入量CPM值比較（±s，n＝3）

注：與常氧組比較，??P＜0.01；與低氧組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

時點 常氧組 低氧組 Ad?βGal＋低氧組Ad?Gax＋低氧組0 h 5935.77±831.54 5954.63±833.56 5944.23±832.18 5950.22±833.07 1 h 5897.98±826.15 9846.69±1378.54?? 9839.72±1377.58?? 8125.37±1137.55??△△3 h 5967.12±835.41 13 068.92±1829.67?? 13 110.11±1835.42?? 11 366.45±1591.31??△△6 h 5929.43±830.26 14 183.65±1985.73?? 14 179.95±1985.19?? 11 973.34±1676.28??△△12 h 5885.83±824.16 12 673.62±1774.31?? 12 701.29±1778.18?? 12 983.86±1817.75??△24 h 5942.74±831.98 8125.47±1137.57?? 8136.24±1139.08?? 8530.29±1194.32??△

表2 在各種條件下PAECs凋亡率比較（±s，％，n＝3）

表2 在各種條件下PAECs凋亡率比較（±s，％，n＝3）

注：與常氧組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與低氧組比較，△△P＜0.01

組別 0 h 1 h 3 h 6 h 12 h 24 h常氧組 3.95±0.55 3.98±0.57 3.88±0.54 3.91±0.55 3.89±0.54 3.87±0.54低氧組 3.99±0.56 2.05±0.29? 2.03±0.28? 1.95±0.27? 3.07±0.43? 2.39±0.33?Ad?βGal＋低氧組 3.89±0.54 2.10±0.29? 2.07±0.29? 2.13±0.30? 3.12±0.44? 2.28±0.32?Ad?Gax＋低氧組 3.97±0.56 10.35±1.45??△△11.34±1.59??△△14.45±2.03??△△7.55±1.06?△△ 6.17±0.86?△△

2.4 Ad?Gax基因轉染對PAECs周期的影響 與常氧組同時相比較，低氧組PAECs的G0/G1期比例明顯降低（P＜0.05、P＜0.01），低氧1～6 h，低氧組PAECs的G0/G1期比例漸降，6 h最低，低氧12、24 h緩慢上升；而S期和G2/M期比例顯著增加（P＜0.05、P＜0.01），S期比例低氧6 h最大。與常氧組同時點相比較，Ad?βGal＋低氧組內皮細胞G0/G1期、S期和G2/M期比例出現與低氧組類似的變化，Ad?βGal＋低氧組與低氧組各指標無統計學差異（P均＞0.05）；與常氧組同時相比較，Ad?Gax＋低氧組PAECs的G0/G1期比例均顯著上升（P＜0.05、P＜0.01），與低氧組比較，G0/G1期比例也均明顯增加（P＜0.01、P＜0.05），低氧1～6 h增幅漸大，6 h時增幅最大，低氧12 h、24 h增幅減小；與常氧組和低氧組同時相比較，Ad?Gax＋低氧組PAECs的S期和G2/M期比例顯著降低（P＜0.01、P＜0.05），6 h時降到最低值。見表3。

表3 肺內皮細胞在各種條件下細胞周期變化結果比較（± s，％，n＝3）

表3 肺內皮細胞在各種條件下細胞周期變化結果比較（± s，％，n＝3）

注：與常氧組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與低氧組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 G0/G1 S G2/M常氧組0 h 72.49±10.14 22.32＋3.12 5.18＋0.73 1 h 73.38±10.27 21.94＋3.07 4.69＋0.65 3 h 72.98±10.21 22.01＋3.08 5.03＋0.71 6 h 72.01±10.08 22.85＋3.20 5.13＋0.72 12 h 73.04±10.22 21.92＋3.06 5.04＋0.71 24 h 72.58±10.16 22.22＋3.11 5.19＋0.73低氧組0 h 72.61±10.17 22.52＋3.15 5.11＋0.71 1 h 62.58±8.76?? 24.66＋3.45? 12.76±1.79??3 h 59.23±8.29?? 26.78±3.75?? 13.89±1.94??6 h 56.68±7.94?? 36.49±5.11?? 6.84±0.96?12 h 62.32±8.72?? 33.61±4.71?? 4.03±0.57?24 h 70.25±9.84? 25.12±3.52? 4.60±0.63?Ad?βGal＋低氧組0 h 72.71±10.15 21.99±3.08 5.29±0.74 1 h 61.97±8.68?? 24.75±3.47?? 13.28±1.86??3 h 59.78±8.36?? 27.67±3.87? 12.54±1.76??6 h 55.98±7.84?? 37.13±5.19?? 6.88±0.96??12 h 62.41±8.73?? 33.91±4.74?? 3.67±0.51?24 h 69.98±9.80? 25.36±3.55? 4.65±0.65?Ad?Gax＋低氧組0 h 72.40±10.13 22.16±3.12 5.20±0.73 1 h 76.34±10.69?△△12.94±1.78??△△10.67±1.48??△△3 h 80.45±11.26??△△11.57±1.62??△△7.97±1.12?△△6 h 86.17±12.34??△△10.27±1.44??△△3.55±0.49?△△12 h 75.04±10.39?△△12.02±1.68??△△12.93±1.81??△△24 h 73.93±10.35?△ 12.96±1.81??△△13.10±1.83??△△

3 討論

本研究采用比較準確反映細胞增殖的先進方法（3H?TdR摻入法）和比較準確反映細胞周期和凋亡率的先進手段（流式細胞術），觀察Ad?Gax基因轉染對體外原代培養的PAECs增殖、凋亡和細胞周期的影響。結果發現，低氧早期內皮細胞增殖加速，而此時增強Gax基因的表達可抑制細胞的異常增殖，抑制細胞從G0/G1期進入S期和G2/M期，并誘導細胞凋亡；隨著低氧時間的不斷延長，細胞增殖受到抑制，而此時增強內皮細胞中Gax基因表達卻又激活細胞增殖，促進細胞從G0/G1期進入S期和G2/M期比例，抑制凋亡，以此來維持細胞的數量。可見，Gax對維持內皮細胞數量的動態平衡具有雙向調節作用。

Gax基因是在1993年由Gorski等［5］克隆出的一種同源異形盒（homeobox）基因，其編碼的蛋白是一種核轉錄因子，能夠激活或抑制其下游基因的表達。Gax基因抑制內皮細胞異常增殖。增強內皮細胞Gax基因表達可通過p21高表達來抑制促血管生成因子所致的內皮細胞表型轉變［6］。體外實驗結果顯示腺病毒介導Gax基因轉染抑制內皮細胞遷移［7］。本研究結果也證實Gax基因過表達抑制內皮細胞的異常增殖，與上述研究結果相符。然而，Gax基因也能促進內皮細胞的增殖。研究發現，增強人腦內皮細胞Gax基因表達能促進新的血管生成，即Gax基因過表達可促進人腦內皮細胞的增殖，提高細胞數量，改善神經血管功能失調［8］。本研結果證實在低氧處理后期，Gax過表達可促進內皮細胞增殖，與上述結果一致。

從本研究結果可以得出Gax基因可能只對異常增殖的細胞具有誘導凋亡的作用，以及Gax對內皮細胞生物學功能具有雙向調節作用的新觀點。本研究結果表明，當低氧刺激使PAECs數量異常增加時，Gax基因起到抑制細胞數量的作用，而當低氧刺激時間越長，細胞數量逐漸減少時，此時Gax基因卻起到阻止細胞數量減少的作用。因此，我們認為，內皮細胞在低氧早期，低氧可能誘發細胞內源性的自我保護機制，激活細胞內促增殖信號通路，促進細胞從G0/G1期進入S期和G2/M期，促進細胞的增殖，抑制細胞凋亡；而當低氧積累到一定程度，促細胞增殖信號通路漸漸失活，抑制細胞從G0/G1期進入S期和G2/M期，細胞增殖受到抑制，而凋亡現象減弱。我們推測，當細胞出現異常增殖時，Gax基因就啟動細胞內抑制細胞數量的機制，而當細胞數量出現異常減少時，Gax基因卻啟動細胞內維持細胞數量的機制。而這些機制尚需深入研究。

［1］ McLaughlin VV，Archer SL，Badesch DB，et al.ACCF/AHA 2009 expert consensus documenton pulmonary hyper?tension a report of the American College of Cardiology Foundation Task Force on ExpertConsensus Documents and the American Heart Association developed in collaboration with the American College of Chest Physicians；American Thoracic Society，Inc.；and the Pulmonary Hypertension Association［J］.J Am Coll Cardiol，2009，53（17）：1573?1619.

［2］ Xia S，Tai X，Wang Y，et al.Involvement of Gax gene in hypoxia?induced pulmonary hypertension，proliferation，and apoptosis of arterial smooth muscle cells［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2011，44（1）：66?73.

［3］ 夏世金，董競成，白莉，等.Ad?Gax轉染對缺氧性大鼠肺動脈平滑肌細胞凋亡及其相關基因表達的影響［J］.中華內科雜志，2007，46（9）：755?759.

［4］ 夏世金，董競成，邰先桃，等.Gax基因過表達對低氧性大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖及周期的作用［J］.華西醫學，2008，23（3）：562?565.

［5］ Gorski DH，Lepage DF，Patel CV，et al.Molecular cloning of a diverged homeobox gene that is rapidly down?regulated during the G0/G 1 transition in vascular smoothmuscle cells［J］.Mole Cell Biol，1993，13（6）：3722?3733.

［6］ Gorski DH，Leal AJ.Inhibition of endothelial cell activation by the homeobox gene Gax［J］.JSurg Res，2003，111（1）：91?99.

［7］ Patel S，Leal AD，Gorski DH.The homeobox gene Gax in?hibits angiogenesis through inhibition of nuclear factor?kap?paB?dependent endothelial cell gene expression［J］.Cancer Res，2005，65（4）：1414?1424.

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Effect of Gax gene transfer on proliferation，apoptosis and cell cycle of hypoxic pulmonary arterialendothelial cells

XIA Shi?jin.Shanghai Institute ofGeriatrics；WU Jun?zhen，SUN Tao.Department ofGeriatrics，Huadong Hospital，Fu?dan University，Shanghai200040，China；HU Ming?dong，QIAN Gui?sheng.Department of Respiratory Diseases，Xinqiao Hospital，Third Military Medical University，Chongqing 400037，China

Objective To study the effect of Gax gene transfer on proliferation，apoptosis and cell cycle of hypoxic pulmonary arterial endothelial cells. M ethods Rat pulmonary arterial endothelial cells（PAECs）were divided into 4 groups：non?transfected normoxia goup（normoxia group），untransfected hypoxic treatment group（hypoxia group），Ad?βGal transfection and hypoxic treatment group（Ad?βGal＋hypoxia group），Ad?Gax transfection and hypoxic treatment group（Ad?Gax＋hypoxia group）.Under conditions of normoxia or hypoxia for 1 hour，3 hours，6 hours and 12 hours，cells proliferation was assessed by using3H?thymidine（3H?TdR）incorporation assay，while cell apoptosis and cell cycle were evaluated with flow cytometry. Results （1）Compared with the normoxia group，the3H?TdR incorporation of PAECs was significantly increased in the hypoxia group and Ad?βGal＋hypoxia group in various time points（P＜0.01）.And it reached themaximum at6?hour?hypoxia time point.The3H?TdR incorporation of PAECs in the Ad?Gax＋hypoxia group was higher than that in the normoxia group（P＜0.01）and lower than the hypoxia group（P＜0.01，P＜0.05）.The largest decline occurred at6?hour?hypoxia time point.（2）Compared with the normoxia group，the apoptosis rate of PAECs were significantly decreased in the hypoxia group and Ad?βGal＋hypoxia group in various time points（P＜0.05）.And it reached theminimum at6?hour?hypoxia time point.The apoptosis rate of PAECs in the Ad?Gax＋hypoxia group was higher than that in the normoxia group and the hypoxia group（P＜0.01，P＜0.05）.And the largest increase occurred at6?hour? hypoxia time point.（3）Compared with the normoxia group，the PAECs in G0/G1phases were significantly decreased in the hy?poxia group and Ad?βGal＋hypoxia group in various time points（P＜0.01，P＜0.05）.And the largest decline occurred at 6?hour?hypoxia time point.Whereas the PAECs in S and G2/Mphases were significantly increased（P＜0.01，P＜0.05）.And the largest increase of S phase PAECs occurred at 6?hour?hypoxia time point.Compared with the normoxia group and hypoxia group at the same time points，the PAECs in G0/G1phases in the Ad?Gax＋hypoxia group significantly increased（P＜0.01，P＜0.05）.And the largest increase of G0/G1pha?ses PAECs occurred at6?hour?hypoxia time point.Whereas the PAECs in Sand G2/M phaseswere significantly decreased（P＜0.01，P＜0.05）.The largest increase of S and G2/M phases PAECs occurred at 6?hour?hypoxia time point. Con?clusions Gax plays a bidirectional regulatory role inmaintaining endothelial cells in number homeostasis via regulating cell proliferation，apoptosis and cycle.

Gax gene；hypoxia；pulmonary arterial hypertension；endothelial cell；proliferation；apoptosis；cell cycle

R 544.16

A

10.3969/j.issn.1003?9198.2013.12.005

2013?07?15）

國家自然科學基金（81270115）

200040 上海市，復旦大學附屬華東醫院上海市老年醫學研究所（夏世金），老年醫學科（吳俊珍，孫濤）；400037 重慶市，第三軍醫大學附屬新橋醫院呼吸科（胡明冬，錢桂生）

Gax基因干預低氧性PAECs增殖、凋亡和周期，雙向調節并維持細胞數量穩態。