以分子動力組學的方法探究嗜鹽酶的嗜鹽機理

王四華，黃可君，張光亞

（華僑大學 化工學院，福建 廈門361021）

嗜鹽菌是一類生活在鹽域環境中的微生物，主要生長在鹽湖、鹽沼、死海和鹽場等環境中，Kushner等［1］將其分為弱嗜鹽菌、中度嗜鹽菌和極端嗜鹽菌.嗜鹽菌體內的蛋白酶不僅能耐受一定的鹽離子強度，而且必需依靠一定的鹽離子強度來維持其結構與功能的穩定 .對于極端嗜鹽菌如嗜鹽古生菌，其體內的酶可在鹽濃度高達5.2 mol·L-1的環境下保持活性和穩定性［2］，而在低鹽濃度下，嗜鹽古生菌體內的蛋白質會變性失活［3］.研究表明：嗜鹽菌主要依靠兩條途徑來維持胞內滲透壓平衡［4-6］，其一是細胞中聚集無機鹽離子如K＋，其二是聚集相容性物質如甜菜堿和四氫嘧啶等.盡管如此，有關嗜鹽蛋白嗜鹽機理尚未有確切的解釋，而從原子層面系統了解蛋白分子在高鹽條件下的動力學行為的研究也非常匱乏 .美國華盛頓大學Daggett教授的研究團隊提出了動力組學（dynameomics）概念，并建立了動力組學數據庫網站（http：／／www.dynameomics.org）［7］，通過對一批具有代表性的蛋白質進行分子動力學模擬，以達到從原子尺度來理解蛋白質的功能和穩定性.分子動力學模擬越來越多地被應用于分子生物學方面，被用來理解、預測、模擬蛋白質、核酸的結構和性質，以及模擬DNA的雙螺旋結構等［8］.用分子動力學模擬的方法研究了嗜熱蛋白與常溫蛋白的分子動力學特性，可以從更微觀的層面上探究嗜熱與常溫蛋白在結構柔韌性上的差異［9-11］.然而，目前尚未見利用分子動力學模擬及組學的方法來探究嗜鹽蛋白穩定性機理的報道 .本文通過對4組嗜鹽蛋白及其同源非嗜鹽蛋白的比較分子動力組學，模擬研究來闡明嗜鹽酶的嗜鹽機理.

1 材料與方法

1.1 數據獲取

所利用的4組目標蛋白分別為二氫葉酸還原酶、蘋果酸脫氫酶、堿性磷酸酶和核苷二磷酸激酶，每組分別包含一個嗜鹽蛋白及其同源的非嗜鹽蛋白.從蛋白質數據庫（PDB）中獲取目標蛋白，且這4組中的嗜鹽蛋白在數據庫（PDB）中的ID號分別為1VDR［12］，2J5R［13］，2X98［14］和2ZUA［15］，對應的4個非嗜鹽蛋白的ID號分別為7DFR［16］，1UXI［17］，1Y6V［18］和2VU5［19］.因每組（嗜鹽與非嗜鹽）蛋白均為同一種酶，且它們蛋白質序列和空間結構非常相似，因此可以用來進行比較分子動力學模擬，以達到探究嗜鹽酶穩定性機理的目的.

1.2 模擬方法

4組目標蛋白中的2J5R和2ZUA均含有4條鏈（A，B，C，D），1VDR，2X98，1Y6V及1UXI均含有兩條鏈（A，B），7DFR及2VU5只含有一條鏈（A）.分別只選取其中的一條鏈（A鏈）作為模擬對象，并將結構中多余的水分子去除；然后，將所有構建的體系分別置入同樣大小的立方水體中，并中和每個體系的電荷，使得所有體系均為電中性.8條鏈所含氨基酸數目及體系最后所包含的原子數，如表1所示.

表1 8條A鏈所含氨基酸數目及體系最后所包含的原子數Tab.1 Amino acid number of eight A chains and the atomic number of the final system

將得到的8組體系分別進行10 ns的分子動力學模擬，一共進行了80 ns的分子動力學模擬.所使用的分子動力學模擬軟件為NAMD［20］及與之相匹配的可視化軟件VMD［21］，選用CHARMm格式力場［22］，所有模擬均在常壓（101.325 k Pa）和常溫（310 K）下進行，且分別采用Langevin Piston和 Langevin Thermostat方法控制壓力和溫度波動.采用PME［23］方法計算長程靜電引力，非鍵相互作用力采用勢能截斷，截斷半徑為1.35 nm，對體系使用周期邊界條件，使用SHAKE算法使水分子保持剛性.時間步長為2 fs，每1 ps輸出一次計算結果，所有模擬均在等溫等壓系綜下進行.

2 結果與分析

2.1 兩類酶的分子動力學模擬所得參數分析

兩類酶（嗜鹽與非嗜鹽）的溶劑可及性表面、鹽橋、氫鍵（蛋白質分子內部及與水溶液形成的氫鍵）、末端距、回旋半徑等參數，如表2所示.由表2可知：只有2X98所行成的鹽橋比1Y6V的要少，這一反常差異可能是由于2X98與1Y6V氨基酸數目差異太大（二者相差19個氨基酸）造成的.除此之外，總體而言，嗜鹽蛋白所形成的鹽橋數目均比非嗜鹽蛋白多，鹽橋能消除鹽離子的屏蔽效應，使分子結構具有剛性，對維持酶和蛋白質的三級結構的穩定起決定性作用.因此，可假定為嗜鹽酶為了在高鹽環境下維持其自身結構的穩定，所形成的鹽橋數目比非嗜鹽酶多.

表2 嗜鹽酶與非嗜鹽酶之間各參數的比較Tab.2 Various parameters comparison of halophilic enzyme and non-halophilic enzyme

從數據上看，嗜鹽酶另一突出特點，無論是其蛋白質分子內所形成的氫鍵還是蛋白質與外界水環境所形成的氫鍵，都比非嗜鹽酶明顯要多.有文獻［24-25］表明，嗜鹽酶所富含的酸性氨基酸殘基可加強蛋白質與溶劑間的相互作用，為了適應高鹽環境，嗜鹽蛋白通過加強與溶劑間的水合能力來維持其結構與功能的穩定.對于嗜鹽蛋白分子內所形成的氫鍵較非嗜鹽蛋白多，這可假定為分子內的氫鍵在一定程度上可維持自身結構的剛性，因此也有利于嗜鹽蛋白適應外界高鹽環境.

文獻［26］通過定點突變的方法發現，嗜鹽蛋白通過降低其自身的溶劑可及性表面的機制來適應細胞外的高鹽環境 .比較表2數據可以發現：嗜鹽酶的溶劑可及性表面確實比非嗜鹽酶的要小，在高鹽缺水的環境下形成這一機制對嗜鹽菌的生命活動是非常有利的.

末端距是用來表征蛋白質分子N端和C端的距離，回旋半徑可用來表示蛋白質分子的緊密度.在這兩項數值上，嗜鹽酶同樣比非嗜鹽酶要小，這說明嗜鹽酶在總體結構上較為緊密，嗜鹽酶結構上的緊湊更有利于在高鹽環境下維持其結構的穩定.

2.2 兩類酶分子均方根偏差值的比較

均方根偏差（RMSD）是指模擬過程中兩種蛋白質各部分原子偏離平均位置的程度，也就是原子運動幅度的大小，其值越大說明運動越劇烈，反映了蛋白質分子結構的剛性與柔性.圖1為4組蛋白酶分子的RMSD值的比較.

從圖1可知：4組酶中嗜鹽酶的RMSD值均比非嗜鹽的要小，嗜鹽酶在結構上比非嗜鹽酶更加剛性，這種特性也更加有利于其在高鹽環境下保持結構的穩定.文獻［10］通過分子動力學模擬的方法研究了嗜熱酶與常溫酶的穩定性機理，發現所研究的嗜熱酶比常溫酶的結構更具有剛性.對于是否大多數極端酶如嗜鹽、嗜熱、嗜壓等結構均更具有剛性，則有待于進一步研究.

圖1 蛋白酶分子的均方根偏差值比較Fig.1 Comparison of RMSD of the four group protein enzymes

2.3 兩類酶各個氨基酸殘基柔性比較

圖2為4組蛋白質酶分子的每個氨基酸殘基的RMSD值，可以直觀地反應出具體部位的氨基酸殘基數（n）波動幅度.從圖2可知：非嗜鹽酶氨基酸殘基波動幅度比嗜鹽酶要大，這與蛋白質整體的RMSD波動趨勢相符.為了能更清楚區分嗜鹽酶殘基與非嗜鹽酶殘基的RMSD值的差異，將嗜鹽酶殘基的RMSD值減去非嗜鹽酶殘基的RMSD值，得到另一曲線，用diff-RMSD表示（圖2）.

比較1VDR與7DFR的每個殘基波動情況，可發現7DFR在殘基15～20上的RMSD值明顯比1VDR要大，且二者在殘基100～120間波動幅度均較小.很明顯，1UXI在殘基80～90上的RMSD值比2J5R要高出很多，而在殘基65～70，95～110之間的RMSD值比2J5R卻要小.比較2ZUA與2VU5的每個殘基波動情況，可發現在殘基40～60間2VU5對應殘基波動幅度更大，同時發現二者C端的波動都很劇烈.1Y6V在N端及殘基85～90，270～300，400～420區間上的RMSD值比2X98明顯高出很多，而2X98在60～65殘基上的RMSD值比1Y6V大.通過比較分析，發現非嗜鹽酶多個部位的氨基酸殘基柔性比嗜鹽酶的要大很多，二者間的這些差異可能就是導致它們適應不同生長環境的一個因素.

圖2 每個氨基酸殘基的柔性Fig.2 The flexibility of the amino acids

2.4 兩類核苷二磷酸激酶三維結構的比較

為了進一步了解兩類酶在三維結構上的差異，以核苷二磷酸激酶為例，對兩類核苷二磷酸激酶進行高級結構的比對.通過在線結構比對工具（http：∥bioinfo3d.cs.tau.ac.il／MultiProt），對2ZUA 和2VU5的三維結構進行比對，發現二者除了在氨基酸40～60處有差異外，其他部位基本相疊合.比較圖2中二者氨基酸殘基柔性大小，可以發現在氨基酸40～60間二者出現了較大差異 .從圖2中可看出：在氨基酸40～60處，2VU5的氨基酸殘基柔性比2ZUA明顯要大.

圖3 2ZUA與2VU5三維結構的比較Fig.3 Comparison of three-dimensional structure of 2ZUA and 2VU5

巧合的是，通過比較二者的三維結構可發現它們正好在氨基酸40～60處出現明顯的差異，如圖3白色圓圈所示，二者在這一區域基本上為螺旋結構 .經仔細比較發現，2ZUA的螺旋結構比2VU5的更加緊湊，從而導致2ZUA的螺旋結構整體上比2VU5的要短.

二者這一區域的差異可能是導致它們適應不同生長環境的一個重要原因，2ZUA的螺旋結構更加緊湊可能會使得其結構更加穩定，從而能適應外界高鹽環境.有趣的是，這一區域非常接近酶的活性中心，而是否與活性中心相互作用且二者的差異是否會導致引起二者活性中心的差異，以及二者的差異是否會導致它們整體結構上的差異，從而表現出不同的特性，有待于進一步研究.

3 討論

有文獻［27-28］報道嗜鹽酶的酸性氨基酸含量比非嗜鹽酶多，來自多個物種的嗜鹽蛋白的平均等電點值為5.嗜鹽蛋白分子表面帶負電氨基酸殘基較多［29-30］，為了適應高濃度鹽環境，嗜鹽菌經過長期的進化導致其體內的蛋白質分子的疏水核心區較?。?1］.嗜鹽蛋白表面的某些氨基酸與水合離子相互作用，有利于維持其構相的穩定［32-34］.許多嗜鹽蛋白的亞基表面存在一些特殊的鹽離子結合位點［21］，嗜鹽酶與溶液中鹽離子的結合一定程度上可以使其結構在高鹽環境下保持穩定.對嗜鹽硫解酶進行的研究表明：為了適應高鹽環境，嗜鹽硫解酶在一定范圍內優先使用較小側鏈的氨基酸，而在高鹽溶液中，使用較小氨基酸殘基能夠明顯降低分子的表面張力，有利于增加分子的靈活性［35］.

理解嗜鹽酶的嗜鹽機理更有利于將嗜鹽酶應用于工業生產中.Selim等［36］利用蛋白質組學技術來研究一株中度嗜鹽菌的嗜鹽機理，發現在不同梯度的鹽離子強度下該菌機體內所產生的蛋白質種類有很大差異.嗜鹽菌在環境生物治理、生物電子和醫藥工業等領域有著廣泛的應用前景［37-39］，其中的嗜鹽酶也具有重大的應用價值.以色列Mevarechy研究小組將嗜鹽的蘋果酸脫氫酶和二氫葉酸酶基因在大腸桿菌中表達成功［40］.文獻［41］探索把嗜鹽極酶用到提高從油井提取原油量的方法中，用嗜鹽極酶可以分解掉瓜兒豆膠的粘性.

文中借鑒華盛頓大學Daggett教授的“動力組學”這一理念，分析了4組嗜鹽蛋白及非嗜鹽蛋白的動力學特性，從原子尺度來探究嗜鹽酶的穩定性機理.對模擬得到的4組酶的運動軌跡進行分析，發現相比非嗜鹽酶，嗜鹽酶能形成更多的鹽橋和氫鍵（無論是分子內氫鍵還是與溶劑所形成的氫鍵）.鹽橋及分子內的氫鍵在整體上能維持蛋白質結構的穩定，這對在高鹽環境中嗜鹽酶保持其結構的穩定是有利的.與溶劑形成較多的氫鍵，和文獻［24-25］報道的嗜鹽酶可加強與溶劑間的相互作用相符.

嗜鹽酶的溶劑可及性表面較非嗜鹽酶小，通過分析RMSD值、末端距及回旋半徑等值發現嗜鹽酶在結構上更具剛性，這一特性在應對外界高鹽環境是非常有利的.通過比較分析發現，4組酶中非嗜鹽酶很多部位的氨基酸殘基柔性比嗜鹽酶明顯要大，猜測正是這一特性才導致嗜鹽酶與非嗜鹽酶適應不同的生長環境.

利用分子動力學模擬提供了一種新的研究嗜鹽蛋白穩定性機理的方法，可為今后其他研究工作提供良好的借鑒.目前實驗所得嗜鹽蛋白晶體結構較少，僅收集到4組同源蛋白，雖然可以得到一些共性的規律，但隨著蛋白質結構數據庫的不斷發展，相信今后可獲得更多的樣本，進行更大規模的蛋白質動力組學研究，使得所得的規律更具代表性，相關研究仍需不斷深入.

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