喘息樣支氣管炎患兒腸道菌群變化與CD3+CD8-IL-17+細胞關系的研究

方 騫，梁慶紅，郝明明，王 燁，張 琳

（河北醫科大學第三醫院兒科，河北石家莊050051）

·論 著·

喘息樣支氣管炎患兒腸道菌群變化與CD3+CD8-IL-17+細胞關系的研究

方 騫，梁慶紅，郝明明，王 燁，張 琳*

（河北醫科大學第三醫院兒科，河北石家莊050051）

目的探討腸道菌群變化、CD3+CD8-IL-17+細胞在喘息樣支氣管炎患兒發病機制中的作用關系。方法采用熒光定量聚合酶鏈式反應（flurogenic quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR）、流式細胞技術和酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）分別檢測47例喘息樣支氣管炎患兒、40例急性支氣管炎患兒、43例同期健康查體兒童糞便中雙歧桿菌和大腸桿菌數量、外周血單個核細胞CD3+CD8-IL-17+濃度和血漿白細胞介素（interleukin-17，IL-17）水平。結果①喘息樣支氣管炎患兒和急性支氣管炎患兒糞便中雙歧桿菌數量、雙歧桿菌/大腸桿菌（bifidobacteria/E.coli，B/E）值低于健康對照組（P＜0.05）；喘息樣支氣管炎患兒雙歧桿菌數量、B/E值低于急性支氣管炎患兒（P＜0.05）。②喘息樣支氣管炎、急性支氣管炎患兒外周血CD3+CD8-IL-17+細胞百分數和血漿IL-17水平均高于健康對照組（P＜0.05）；喘息樣支氣管炎患兒外周血CD3+CD8-IL-17+細胞百分數高于急性支氣管炎患兒（P＜0.05），血漿IL-17水平低于急性支氣管炎患兒（P＜0.05）。③喘息樣支氣管炎和急性支氣管炎患兒外周血CD3+CD8-IL-17+細胞百分數與血漿IL-17水平呈正相關。喘息樣支氣管炎患兒腸道B/E值與外周血CD3+CD8-IL-17+細胞百分數呈負相關。結論喘息樣支氣管炎患兒發病初期即發生腸道菌群紊亂，腸道微生物定植抗力降低，CD3+CD8-IL-17+細胞介導的炎癥反應參與其病理機制。

支氣管炎；雙歧桿菌；大腸桿菌

近10年兒童哮喘發病率呈上升趨勢，流行病學資料顯示85％兒童哮喘在3歲前發?。?］，除了哮喘診斷率提高外，部分原因是對嬰幼兒期喘息樣支氣管炎的診治重視不夠，減少嬰幼兒期喘息反復發作，可降低兒童哮喘的發生風險。哮喘的病因和病理機制復雜，Th1/Th2失衡是其經典發病學說，近年來發現CD3+CD8-IL-17+細胞不僅參與自身免疫性疾病、腫瘤、感染性疾病和急性冠狀動脈綜合征等疾病的發病，且在哮喘等過敏性疾病中發揮重要作用。腸道正常菌群對機體免疫的成熟和發育起到重要作用，并誘導口服免疫耐受。濕疹、食物過敏、過敏性皮炎和哮喘患兒腸道菌群結構發生改變，補充益生菌在防治過敏性疾病中起到積極作用。本研究通過觀察喘息樣支氣管炎患兒腸道菌群變化、外周血單個核細胞CD3+CD8-IL-17+細胞百分數和血漿白細胞介素17（interleukin-17，IL-17）水平，探討腸道菌群結構與CD3+CD8-IL-17+細胞在其發病中的作用關系，為其發病機制提出新觀點，并為益生菌早期應用預防喘息樣支氣管炎反復發作提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇2011年10月—2012年3月在我院兒科住院的喘息急性發作并符合喘息樣支氣管炎診斷標準［2］的47例患兒為A組，其中男性22例，女性25例，年齡1.6～2.5歲，平均（2.10± 0.26）歲；選擇同期入院符合急性支氣管炎診斷標準［2］的40例患兒為B組，其中男性17例，女性23例，年齡1.5～2.8歲，平均（2.20±0.28）歲；選擇同期在我院健康查體兒童43例為C組，其中男性21例，女性22例，年齡1.4～2.5歲，平均（2.1± 0.25）歲。納入標準包括無心、肺、肝或腎疾患；近6個月無呼吸道和消化道感染史；無個人及家族過敏性疾患及其他變態反應性疾病史。排除標準包括入院前2周應用糖皮質激素、抗組胺藥、免疫調節劑；原發或繼發性免疫功能缺陷；活動性肺結核；先天性氣道、肺實質發育異常；先天性心臟??；胃食管反流；有心、肝、腎疾病者；近2個月內發生腹瀉或服用益生菌制劑者；入院前1周使用抗生素者。3組均為石家莊周邊縣市兒童，喂養方式為斷乳后添加輔食，3組性別、年齡、體質量差異均無統計學意義。

1.2 方法：3組均于入院當日或次日清晨空腹下抽取外周靜脈血2mL于肝素鈉抗凝管中，1 500r/min離心10min，取上清液置-20℃冰箱保存備用。同時收集兒童4h內糞便置于無菌干燥瓶，-80℃冰箱保存備用。采用16SrRNA熒光定量PCR檢測各組患兒腸道雙歧桿菌、大腸桿菌數量，應用Corbett Research公司生產的Rotor-Gene熒光定量PCR儀；采用流式細胞術檢測外周血單個核細胞CD3+CD8-IL-17+水平，流式細胞儀Epics XL由美國Beckman coulter公司生產；采用ELISA法檢測血漿中IL-17的水平，人IL-17 ELISA定量檢測試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。實驗步驟按說明書進行。

1.3 統計學方法：應用SPSS13.0統計分析軟件進行數據分析。計量資料以±s表示，分別采用F檢驗和q檢驗；相關性采用Perason直線相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 腸道菌群：A、B組糞便中雙歧桿菌濃度、B/E值均低于C組（P＜0.05）；A組雙歧桿菌濃度、B/E值低于B組（P＜0.05）。見表1。

2.2 外周血單個核細胞CD3+CD8-IL-17+細胞百分數和血漿IL-17水平：A、B組外周血CD3+CD8-IL-17+細胞百分數和血漿IL-17水平高于C組（P＜0.05）；A組外周血CD3+CD8-IL-17+細胞百分數高于B組，血漿IL-17水平低于B組（P＜0.05）。見表2。

2.3 相關性分析：A、B組外周血CD3+CD8-IL-17+百分數與血漿IL-17均呈正相關（r=0.377、0.329，P＜0.05）；A組腸道B/E值與CD3+CD8-IL-17+細胞百分數呈負相關（r=-0.349，P＜0.05）。

表1 3組腸道雙歧桿菌、大腸桿菌菌群數量比較Table 1 Comparision of quantity of fecal m icroorganism s am ong three groups（±s）

表1 3組腸道雙歧桿菌、大腸桿菌菌群數量比較Table 1 Comparision of quantity of fecal m icroorganism s am ong three groups（±s）

*P＜0.0 5 vs group C #P＜0.05 vs group B by q test

Groups n Bifidobacteria（copies/g）B/E A 47 5.22±0.55*#7.81±1.00 0.72±0.11*#E.coli（copies/g）B 40 5.99±0.64*7.87±0.86 0.81±0.24*C 43 8.94±0.85 7.60±1.01 1.17±0.21

表2 3組外周血單個核細胞CD3+CD8-IL-17+細胞百分數和血漿IL-17濃度比較Table 3 Percentage of CD3+CD8-IL-17+（Th17）cells and concentrations of the p lasma IL-17 in three groups（±s）

表2 3組外周血單個核細胞CD3+CD8-IL-17+細胞百分數和血漿IL-17濃度比較Table 3 Percentage of CD3+CD8-IL-17+（Th17）cells and concentrations of the p lasma IL-17 in three groups（±s）

*P＜0.05 vs group C #P＜0.05 vs group B by q test

Groups n CD3+CD8-IL-17+（％）IL-17（ng/L）A 47 0.36±0.10*170.16±37.32*#B 40 0.33±0.10*225.06±58.37*43 0.26±0.11 108.93±21.31 C

3 討 論

世界范圍內哮喘和過敏性疾病發病率普遍增高［3］。不同國家過敏性疾病患病率不同，而且過敏性疾病兒童與健康兒童間腸道菌群的構成也有所不同，主要表現在腸道原居菌和梭狀芽孢桿菌數量的變化。我們立足于微生態學觀點，探討喘息樣支氣管炎患兒腸道菌群變化及與CD3+CD8-IL-17+細胞的作用關系，闡釋腸道菌群與CD3+CD8-IL-17+細胞在兒童喘息發作中的作用機制。

人體腸道菌群是一個復雜的微生態系統，在抵御病原微生物的侵入（防御感染）、限制病原微生物生長、調節免疫應答和促進營養吸收等方面發揮重要作用。流行病學資料顯示過敏兒童與健康兒童相比，腸道梭狀芽胞桿菌數量增多而雙歧桿菌數量減少［4］。本研究顯示，喘息樣支氣管炎和急性支氣管炎患兒腸道雙歧桿菌數量和B/E值均低于健康兒童，而且喘息樣支氣管炎患兒在喘息急性發作時腸道雙歧桿菌數量和B/E值低于急性支氣管炎患兒。表明喘息發作處應激狀態時機體存在低氧血癥，腸道環境發生改變，加之受到病原微生物的侵襲，導致腸黏膜屏障功能受損，引發腸道菌群紊亂。

CD3+CD8-IL-17+細胞是近來發現的不同于Th1、Th2的另一種CD4+T細胞的新亞型，是重要的促炎癥細胞，可通過分泌IL-17誘導多種前炎癥因子和趨化因子。IL-17是T淋巴細胞誘導的炎癥反應的早期啟動因素［5］，是調節炎癥反應的關鍵細胞因子，能誘導平滑肌細胞表達IL-6和IL-8，誘導支氣管上皮細胞表達IL-8、粒細胞集落刺激因子、CXCLl等，并誘導支氣管成纖維細胞表達IL-8、IL-6和CXCL1/Gro-α等，而IL-8和CXCLl是中性粒細胞趨化因子，IL-6和粒細胞集落刺激因子是中性粒細胞生成因子，促進粒細胞增殖，誘導和加重氣道炎癥反應。國內一項研究［6］顯示，5歲以下喘息兒童有特應質高危因素組和無特應質高危因素組IL-17水平均較同期同齡對照組兒童增高。Xiong等［7］的一項動物實驗研究證實，哮喘大鼠肺組織中Th17細胞分泌的IL-17A與支氣管肺泡灌洗液中的嗜酸粒細胞及中性粒細胞增多明顯正相關，因此IL-17A可能與哮喘中嗜酸粒細胞及中性粒細胞增多有關。本研究顯示，喘息樣支氣管炎和急性支氣管炎患兒外周血CD3+CD8-IL-17+細胞百分數和血漿IL-17水平較健康兒童升高。說明CD3+CD8-IL-17+細胞參與了氣道的炎癥，并激活T細胞的分化向CD3+CD8-IL-17+細胞傾斜，引起IL-17分泌增多，兩者間存在直線正相關關系。

CD3+CD8-IL-17+細胞是促進炎癥反應的輔助T細胞，許多細胞因子、免疫細胞、信號分子、Toll樣受體等參與CD3+CD8-IL-17+細胞的分化。國外一項研究［8］發現，特定的腸道共生菌能夠促進小腸黏膜固有層CD3+CD8-IL-17+細胞的分化，不依賴于Toll樣受體、IL-21或IL-23信號途徑，但需要轉化生長因子β的活化作用。大量細菌微生物維持機體的免疫平衡狀態，調節對病原微生物的免疫應答［3］。腸道菌群也可能通過作用于調節性T細胞起到間接調控CD3+CD8-IL-17+細胞的作用。本研究顯示，喘息樣支氣管炎患兒腸道B/E值與外周血CD3+CD8-IL-17+細胞百分數呈直線負相關。說明喘息樣支氣管炎患兒腸道菌群的變化與外周血CD3+CD8-IL-17+細胞的百分數存在關系，菌群的紊亂通過影響腸道黏膜免疫系統或機體免疫應答影響CD3+CD8-IL-17+細胞的分化發育，而且CD3+CD8-IL-17+參與了發病初期的炎癥反應，并加劇了腸道微生態環境的改變。

哮喘是一個復雜的免疫性疾病，眾多的細胞因子和炎癥介質參與發病過程，CD3+CD8-IL-17+細胞亞群的發現，彌補了Th1/Th2失衡機制的不足，但CD3+CD8-IL-17+和IL-17作用在哮喘發病的不同階段，尤其在免疫細胞、分子網絡中的相互調節作用及其與腸道菌群的具體作用機制還有待進一步揭示。喘息樣支氣管炎患兒腸道雙歧桿菌數量減少、腸道微生物定植抗力降低，腸道菌群的紊亂影響機體的免疫反應，加劇炎癥反應，所以在防治疾病的同時糾正腸道菌群失衡是必要的，這又為我們提出了一系列問題，攝入益生菌是否能預防哮喘和過敏性疾病，還需要大量的臨床和實驗室研究，以提供證據。在喘息樣支氣管炎發病早期積極控制炎性反應、改善喘息癥狀同時調節腸道菌群紊亂，不失為一種預防和治療哮喘和過敏性疾病的新途徑。

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（本文編輯：劉斯靜）

圖2 成人型多囊腎（LK：左腎）

圖3 孕婦雙腎（LK：左腎；RK：右腎）

圖4 胎兒單純性腎回聲增強（LK：左腎；RK：右腎）

討 論在常規產前超聲檢查中，遇到胎兒腎臟回聲增強應該考慮以下疾病：①嬰兒型多囊腎，為常染色體隱性遺傳。超聲表現為雙側腎臟對稱性、均勻性增大；孕晚期胎兒雙側腎臟顯著增大，可達正常腎臟的3～10倍；雙側腎臟回聲增強，以腎髓質為主；孕晚期羊水過少。例1即為典型病例。②成人型多囊腎，為常染色體顯性遺傳。超聲表現為雙側腎臟增大，回聲增強，但與嬰兒型多囊腎相反的是，成人型多囊腎可較好地顯示低回聲的腎髓質，且腎髓質無明顯增大；羊水量正常。父母一方有多囊腎超聲表現是診斷胎兒成人型多囊腎的有力證據。例2是典型病例。③染色體異常胎兒腎臟表現。④巨細胞病毒感染是腎臟回聲增強的另一個常見原因，但如果檢出腦積水、腦室周圍鈣化灶、小頭畸形時，則提示此種感染的可能性較大。⑤單純性胎兒腎臟回聲增強或腎臟發育不良。例3則是典型病例。

綜上所述，當發現胎兒腎臟回聲增強時應該重點觀察腎臟的大小、回聲增強部位以及羊水量的多少，尤其是動態觀察，以期為臨床處理提供必要的依據。另外，對單純性胎兒腎臟回聲增強也不能掉以輕心，在產后應加強隨訪，其中有些可能存在腎臟問題［1-2］。

【參考文獻】

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（本文編輯：趙麗潔）

STUDY OF RELATIONSHIP BETWEEN INTESTINAL NORMAL FLORA AND CD3+CD8-IL-17+IN CHILDREN W ITH ASTHMATOID BRONCHITIS

FANG Qian，LIANG Qinghong，HAO Mingming，WANG Ye，ZHANG Lin*
（Department of Pediatrics，the Third Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang 050051，China）

Objective To investigate the variations of intestinal flora and the relationship between intestinal flora and CD3+CD8-IL-17+cells in children with asthmatoid bronchitis.MethodsForty-seven children with asthmatoid bronchitis，forty chilidren with acute tracheitis and forty-three healthy children were selected in the corresponding time period.The bifidobacteria and E.coli DNA in fecal samples were detected by fluorogenic quantitative polymerase chain reaction.The percentage of CD3+CD8-IL-17+cells in peripheral blood mononuclear cellswere detected by flow cytometrie analysis. Interleukin-17（IL-17）in plasma was detected by enzyme linked immunosorbent assay.Results①The quantity of fecal bifidobacteria and bifidobacteria/E.coli（B/E）values in children with asthmatoid bronchitis and acute tracheitiswere lower than those in healthy children（P＜0.05）；The quantity of fecal bifidobacteria and B/E values in children with asthmatoid bronchitis were lower than those in childrenwith acute tracheitis（P＜0.05）.②The percentage of CD3+CD8-IL-17+cells and the IL-17 level in children with asthmatoid bronchitis and acute tracheitiswere higher than those in healthy children（P＜0.05）.The percentage of CD3+CD8-IL-17+cellswere higher in children with asthmatoid bronchitis，but the IL-17 level was lower than that in children with acute tracheitis（P＜0.05）.③There was a positive linear corelation between the percentage of CD3+CD8-IL-17+cells and the IL-17 level in children with asthmatic bronchitis and acute tracheitis.Therewas a negative linear corelation between B/E ratio and the percentage of CD3+CD8-IL-17+cells in children with asthmatic bronchitis.ConclusionThe construction of intestinal flora in children with asthmatoid bronchitis were disordered and intestinal microbial colonization resistance decreased；CD3+CD8-IL-17+cells in children with asthmatoid bronchitis are involved in the early period of disease and play an important role in the pathogenesis of asthmatoid bronchitis.

bronchitis；bifidobacteria；escherichia coli

R725.6

A

1007-3205（2013）08-0908-04

2013-03-18；

2013-04-15

河北省醫學科學研究重點課題計劃項目（20120103）

方騫（1986-），女，河南南陽人，河北醫科大學第三醫院醫學碩士研究生，從事兒科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：Lzhang79@126.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.08.014