纈沙坦對尾加壓素Ⅱ誘導腎小管上皮細胞凋亡的影響

任韞卓，史永紅，韋金英，杜春陽，李宏博，段惠軍

（河北醫科大學基礎醫學院病理學教研室，河北石家莊050017）

·論 著·

纈沙坦對尾加壓素Ⅱ誘導腎小管上皮細胞凋亡的影響

任韞卓，史永紅，韋金英，杜春陽，李宏博，段惠軍*

（河北醫科大學基礎醫學院病理學教研室，河北石家莊050017）

目的 觀察纈沙坦對尾加壓素Ⅱ（urotensinⅡ，UⅡ）對腎小管上皮細胞凋亡的影響。方法將體外培養人腎小管上皮細胞（human kidney proximal tubular cell，HK-2）分為正常對照組、10-8mol/L UⅡ刺激組和10-8mol/L UⅡ+10μmol/L纈沙坦組。采用Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞術（flow cytometry，FCM）檢測細胞凋亡百分比；Western-Blot檢測Bax、Bcl-2的表達；熒光實時定量PCR（Real time-PCR）檢測Bax、Bcl-2mRNA水平變化。結果①FCM法檢測顯示，與正常對照組相比，10-8mol/L UⅡ刺激組細胞凋亡百分比顯著升高（P＜0.01）。10μmol/L纈沙坦能顯著降低10-8mol/L UⅡ誘導細胞凋亡的百分比（P＜0.01）。②Western-Blot顯示，10-8mol/L UⅡ刺激組，與正常對照組相比，Bcl-2表達顯著降低（P＜0.05），Bax蛋白表達無明顯變化（P＞0.05），Bax/Bcl-2比率明顯升高（P＜0.01）。與UⅡ刺激組相比，纈沙坦使Bcl-2表達顯著升高（P＜0.01），Bax蛋白表達無明顯變化（P＞0.05），Bax/Bcl-2比率明顯降低（P＜0.01）。③Real time-PCR顯示，10-8mol/L UⅡ刺激組細胞Bcl-2mRNA表達顯著減少（P＜0.01），BaxmRNA無明顯變化（P＞0.05）。與UⅡ刺激組相比，纈沙坦顯著升高Bcl-2mRNA水平（P＜0.01），BaxmRNA無明顯變化（P＞0.05）。結論纈沙坦的腎臟保護作用可能部分是通過抑制UⅡ誘導的腎小管上皮細胞凋亡實現的。

腎小管，近端；上皮細胞；纈沙坦

尾加壓素Ⅱ（urotensinⅡ，UⅡ）是近年發現的體內最強的縮血管活性肽，在腎臟有著豐富的表達，尤其是腎小管和集合管上皮細胞［1］。研究顯示，UⅡ在腎臟的高表達有可能有重要的意義［2］。UⅡ在腎臟病變中的作用正是研究的熱點。腎小管上皮細胞在各種病因作用下凋亡增加是腎間質纖維化發生發展的關鍵和核心環節之一。纈沙坦（valsartan，Val）是近年來發現的一種血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑（angⅡtype 1 receptor antagonism，AT1RA），從受體水平上阻斷AngⅡ的生物學作用。AT1RA在降低血壓、減少尿蛋白、改善腎小球和小管間質損傷以及保護腎功能上具有肯定的效果。本研究著重探討纈沙坦能否改善UⅡ誘導的人腎小管上皮細胞（human kidney proximal tubular cell，HK-2）的凋亡。

1 資料與方法

1.1 材料：人腎小管細胞HK-2（ATCC Manassas，VA，USA）。纈沙坦，北京諾華制藥有限公司。UⅡ，美國Sigma公司。小鼠抗Bax單克隆抗體（P-19），兔抗Bcl-2多克隆抗體。Real time PCR試劑盒（Promega公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和分組刺激實驗：常規培養細胞，待HK-2細胞達75%～85%匯合后，用無血清培養基同步24h。分成正常對照組、10-8mol/L UⅡ刺激組和10-8mol/L UⅡ+10μmol/L纈沙坦組。干預48h后收集細胞觀察。

1.2.2 Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞術（flow cytometric，FCM）檢測細胞的凋亡百分比：①細胞用不含EDTA的胰酶消化收集；②用PBS洗滌細胞2次，收集1～5×105細胞；③加入500μL Binding Buffer懸浮細胞；④加入5μL Annexin VEGFP混勻后，加入5μL Propidium Iodide，混勻；⑤室溫、避光、反應5～15min；⑥1h內進行流式細胞儀的觀察和檢測。激發波長Ex=488nm；發射波長Em=530nm。Annexin V-EGFP的綠色熒光通過FITC通道（fluorescene 1，FL1）檢測；PI紅色熒光通過PI通道（fluorescene 3，FL3）檢測。應用Muticycle AV（FACSAria，BD Biosciences，CA，USA）分析軟件計算各期細胞百分率。

1.2.3 Western-Blot檢測Bax和Bcl-2蛋白水平：

加入細胞裂解液，冰浴2h，4℃、12 000r/min離心20min，Lowry法測定上清液蛋白濃度。經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后電轉移至聚偏二氟乙烯膜；質量分數0.05的脫脂奶粉封閉聚偏二氟乙烯膜2h，分別加入Bax、Bcl-2抗體，4℃過夜，洗膜后加辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠或兔抗體（1∶4 000稀釋），37℃孵育2h；洗膜后加ECL試劑，ODYSSEY遠紅外雙色熒光成像系統顯影（LI.COR Gene Company，USA）。用美國UVP公司LabWorks 4.5分析系統軟件對Western條帶進行定量分析。

1.2.4 熒光實時定量PCR檢測Bax和Bcl-2表達變化：Trizol法提取細胞總RNA，進行反轉錄。熒光實時定量PCR采用20μL反應體系，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（2X）10μL，ROX Reference Dye（50X）0.4μL，反轉錄產物2μL，上下游引物（終濃度為1μg/L）各0.8μL，ddH2O 6μL。反應條件為，95℃30s→95℃5s→55℃30s→72℃30s共40個循環。根據比較法計算基因表達相對量，采用公式2-ΔΔCt計算基因表達的相對倍數變化。引物序列見表1。

表1 實時定量PCR引物列表Table 1 Primer sequences used for Real-tim e PCR analysis

1.3 統計學方法：應用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 FCM檢測細胞凋亡百分比：Annexin V+PI雙染流式細胞計數散點圖以Annexin V橫軸，PI為縱軸，左上象限為損傷細胞，右上為晚期凋亡細胞或者壞死細胞，左下為陰性正常細胞，右下為早期凋亡細胞。正常對照組細胞凋亡率為（2.25±0.12）%，UⅡ刺激組細胞凋亡率為（46.92±0.36）%。與正常組相比，UⅡ刺激組細胞凋亡顯著增加（P＜0.01）。

UⅡ+纈沙坦組細胞凋亡率為（27.21±0.04）%，較UⅡ刺激組明顯減少（P＜0.01）。

2.2 Western-Blot檢測Bax和Bcl-2蛋白表達：與正常對照組相比，UⅡ刺激組Bcl-2蛋白表達顯著降低（P＜0.01），Bax蛋白表達無明顯變化（P＞0.05），Bax/Bcl-2比率顯著增加（P＜0.01）。與UⅡ組相比，UⅡ+纈沙坦組Bcl-2蛋白水平明顯升高（P＜0.01），Bax蛋白表達無明顯變化（P＞0.05），Bax/Bcl-2比率降低（P＜0.05），見圖1，2。

圖1 3組HK-2細胞Bax和Bcl-2蛋白表達Figure 1 The expression levels of Bax and Bcl-2 in three groups

圖2 3組HK-2細胞胞Bax/Bcl-2比率Figure 2 The ratio of Bax/Bcl-2 in three groups

2.3 Real-time PCR檢測Bax和Bcl-2mRNA水平：與正常對照組相比，UⅡ刺激組Bcl-2 mRNA表達明顯減少（P＜0.01），Bax mRNA水平無明顯變化（P＞0.05）。與UⅡ刺激組相比，UⅡ+纈沙坦組Bcl-2mRNA顯著升高，但BaxmRNA無明顯變化。見表2。

表2 UⅡ刺激對HK-2 Bcl-2 and Bax mRNA表達的影響Table 2 Effect of UⅡinterference on Bcl-2 and Bax mRNA in HK-2 (±s，n=6）

表2 UⅡ刺激對HK-2 Bcl-2 and Bax mRNA表達的影響Table 2 Effect of UⅡinterference on Bcl-2 and Bax mRNA in HK-2 (±s，n=6）

*P＜0.01 vs NG #P＜0.01 vs UⅡG by q test

Groups Bcl-2 mRNA BaxmRNA NG 1.00±0.00 1.00±0.00 UⅡG 0.08±0.02*0.92±0.13 UⅡ+Val 0.56±0.11#0.89±0.19

3 討 論

UⅡ最早是從魚的脊髓尾部下垂體中分離出的生長抑素樣環肽，是目前已知最強的縮血管活性肽。研究［3-5］表明，在許多心血管和代謝性疾病中UⅡ及其受體的水平均有上調，包括Ⅱ型糖尿病、腎功能失調、動脈粥樣硬化和肥胖等，發揮著收縮血管、舒張血管及促絲裂等作用。近年來UⅡ在腎臟的病理生理作用受到關注［6］。在慢性腎臟病及腎移植患者中UⅡ水平明顯升高［7-9］。凋亡是導致腎小管損傷的一種普遍機制。以往認為腎小管上皮細胞的增殖和肥大是腎間質纖維化、腎衰竭的主要原因。可是近幾年的研究［10-11］表明，腎小管上皮細胞，尤其是近曲小管上皮細胞的凋亡在腎間質纖維化及腎功能的進一步喪失中起著重要作用。

腎素-血管緊張素-醛固酮系統，尤其是血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ），參與了腎臟疾病的病變發展，不僅在血流動力學調節而且在腎硬化和炎癥性、纖維化中起重要作用［12］。纈沙坦是一種AngⅡ的多肽類似物，可以通過與AT1受體結合，阻斷AngⅡ與AT1受體結合而發揮一系列作用。AT1RA除降壓外，還具有明確的非血壓依賴性腎臟保護作用。本研究重點觀察纈沙坦能否改善UⅡ誘導的人HK-2的凋亡。首先選取了具有較高特異度和敏感度的Annexin V/PI雙染流式細胞分析發現UⅡ刺激細胞后凋亡百分率較正常對照組顯著升高，纈沙坦和UⅡ的共同孵育能夠顯著降低凋亡率。同時還檢測了凋亡抑制基因Bcl-2及凋亡促進基因Bax的變化。它們與細胞凋亡或存活關系尤為密切，在受到刺激后由它們之間的不同比例來決定細胞的死亡或存活［13-14］。Bcl-2是細胞凋亡調控蛋白家族中最具特征的成員，通過調節細胞死亡啟動因子和阻滯因子之間的平衡來抑制凋亡的發生。本研究結果顯示，UⅡ刺激后Bcl-2蛋白和mRNA水平顯著下降，Bax表達無明顯變化，Bax/Bcl-2比率顯著下降。應用纈沙坦干預后，HK-2的Bcl-2蛋白和mRNA水平較UⅡ刺激組顯著上升，Bax表達無明顯變化，Bax/Bcl-2比率下降也得到改善。推斷纈沙坦的腎臟保護作用可能是部分通過抑制UⅡ誘導人腎小管上皮細胞的凋亡實現的。今后將對沙坦類藥物的腎臟保護機制做更深入的研究。

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（本文編輯：劉斯靜）

EFFECT OF VALSARTAN ON UROTENSINⅡINDUCED-APOPTOSIS IN HUMAN KIDNEY PROXIMAL TUBULAR EPITHELIAL CELL

REN Yunzhuo，SHIYonghong，WEIJinying，DU Chunyang，LIHongbo，DUAN Huijun*
(Department of Pathology，the School of Basic Sciences，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）

ObjectiveTo observe the effect of valsartan on urotensinⅡ（UⅡ）inducedapoptosis in human kidney proximal tubular cell（HK-2）.MethodsHK-2 cellswere divided into three groups：normal group，10-8mol/L UⅡgroup，10-8mol/L UⅡ+10μmol/L Val group.Cellswere stained by annexin V/propidium iodide（PI）and apoptosis of HK-2 was analyzed by flow cytometry（FCM）.The expression levels of Bax and Bcl-2 were observed by Western-Blot.Real time-PCR was performed to assess the levels of Bax，Bcl-2mRNA.ResultsCompared with normal group（NG），the percentage of cell apoptosis significantly increased in HK-2 in UⅡstimulation group（P＜0.01）.FCM showed that valsartan made the cell apoptioic ratemuch lower than that of HK-2 of UⅡ-induced.The expressions of Bcl-2 protein and mRNA were decreased in UⅡ-stimulated HK-2 cell（s P＜0.05）.Valsartan could upregulate the expression of Bcl-2 protein and mRNA but it did not have any effect on the expression of Bax.The ratio of Bax/Bcl-2 was significantly increased in UⅡ-stimulated HK-2 cells（P＜0.01）. Valsartan could also greatly ameliorate the increase of ratio of Bax/Bcl-2（P＜0.01）.ConclusionValsartan has some renal protective effects on renal interstitial fibrosis，partly through inhibiting UⅡinduced-apoptosis in human kidney proximal tubular cell.

kidney tubules，proximal；epithelial cells；valsartan

R332

A

1007-3205（2013）09-0993-04

2013-08-01；

2013-08-11

國家自然科學基金（30100244）；河北省教育廳科學研究計劃項目（2007130）；河北省自然科學基金（30100098）

任韞卓（1978-），女，河北石家莊人，河北醫科大學基礎醫學院副教授，醫學博士，從事腎臟病理學研究。

*通訊作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.09.001