慢性坐骨神經(jīng)損傷對(duì)MCP/DAF雙基因重組轉(zhuǎn)染大鼠的行為學(xué)影響

王金保，王 琪，朱海娟，蔡增華，王 媛

（1.中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院麻醉科，河北石家莊050082；

2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院感染控制科，河北石家莊050011）

·論 著·

慢性坐骨神經(jīng)損傷對(duì)MCP/DAF雙基因重組轉(zhuǎn)染大鼠的行為學(xué)影響

王金保1，王 琪1，朱海娟1，蔡增華1，王 媛2

（1.中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院麻醉科，河北石家莊050082；

2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院感染控制科，河北石家莊050011）

目的評(píng)價(jià)慢性坐骨神經(jīng)損傷對(duì)膜輔助因子蛋白（membrame cofactor protein，MCP）/衰變加重因子（decay accelerating facter，DAF）重組轉(zhuǎn)染大鼠的行為學(xué)影響，為神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain，NPP）大鼠的治療探索新的靶標(biāo)。方法MCP/DAF雙基因重組轉(zhuǎn)染SD大鼠24只，體質(zhì)量200～250kg，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為Rsham和RCCI2組（n=12）；健康雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量200～250kg，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為Nsham和NCCI2組（n=12）。RCCI組和NCCI組大鼠行右側(cè)坐骨神經(jīng)4道環(huán)形結(jié)扎，Rsham組和Nsham組大鼠只暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)，不予環(huán)形結(jié)扎。分別于術(shù)前1d和術(shù)后1、3、7d測(cè)定大鼠的熱痛閾值和機(jī)械痛閾值。術(shù)后7d測(cè)定痛閾值后，立即處死大鼠，取L4～5脊髓組織，其中6只用于免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)（測(cè)定OX-42表達(dá)），另外6只用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)（測(cè)定MCPmRNA和DAFmRNA）。結(jié)果與Nsham組相比，NCCI組大鼠術(shù)后1、3、7d熱痛閾值和機(jī)械痛閾值降低（P＜0.05），脊髓組織中OX-42表達(dá)升高（P＜0.05），MCPmRNA和DAFmRNA表達(dá)下降（P＜0.05），Rsham組和RCCI組大鼠術(shù)后上述時(shí)間點(diǎn)熱痛閾值和機(jī)械痛閾值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），OX-42表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），MCPmRNA和DAFmRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與NCCI組相比，RCCI組大鼠術(shù)后上述時(shí)間點(diǎn)熱痛閾值和機(jī)械痛閾值升高（P＜0.05），脊髓中OX-42表達(dá)下降（P＜0.05），MCPmRNA和DAFmRNA表達(dá)升高（P＜0.05）。結(jié)論MCP/DAF重組轉(zhuǎn)染大鼠可抑制慢性坐骨神經(jīng)損傷引起的痛覺過敏形成，MCP/DAF可作為NPP治療的新靶標(biāo)。

坐骨神經(jīng)痛；痛閾；大鼠

神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain，NPP）是一組頑固性疾病，由于其發(fā)病機(jī)制不清，目前缺乏有效治療手段。研究［1］表明，NPP大鼠脊髓背角發(fā)生補(bǔ)體異常活化且膜結(jié)合性補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白膜輔助因子蛋白（membrane cofactor protein，MCP）、衰變加重因子（decay accelerating factor，DAF）表達(dá)下降。那么，改變脊髓中MCP、DAF表達(dá)是否能影響NPP的形成，目前尚未見報(bào)道。本研究探討慢性坐骨神經(jīng)損傷對(duì)MCP/DAF重組轉(zhuǎn)染大鼠的行為學(xué)影響，旨在為NPP的治療提供新的靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：MCP/DAF雙基因重組轉(zhuǎn)染SD大鼠（由武漢大學(xué)生命科學(xué)院提供）24只，體質(zhì)量200～250kg，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為Rsham和RCCI2組（n=12）；健康雄性SD大鼠（由武漢大學(xué)生命科學(xué)院提供）24只，體質(zhì)量200～250kg，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為Nsham和NCCI2組（n=12）。RCCI組和NCCI組大鼠行右側(cè)坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷，Rsham組和Nsham組大鼠只暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)。術(shù)后7 d測(cè)定痛閾值后，立即處死大鼠，取L4～5脊髓組織，其中6只用于免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)（測(cè)定OX-42表達(dá)），另外6只用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)（測(cè)定MCPmRNA和DAFmRNA）。

1.2 坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷：RCCI組和NCCI組參照文獻(xiàn)［2］介紹的方法行大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷。腹腔注射戊巴比妥鈉40mg/kg麻醉后，取俯臥位，固定于自制手術(shù)臺(tái)上，用硫化鈉均勻的涂在手術(shù)區(qū)域，2min后用棉簽輕輕擦掉手術(shù)區(qū)域的毛發(fā)，用碘伏消毒2遍后鋪洞巾，在股骨外側(cè)上方縱形切開皮膚，順肌紋鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)，游離周圍組織，在坐骨神經(jīng)三叉分支的近端約5mm處，分別用4-0鉻制羊腸線環(huán)繞坐骨神經(jīng)干松弛結(jié)扎4道，間距約1mm，要求僅留下縊痕而不阻斷神經(jīng)和血供，以引起小腿肌肉輕度顫動(dòng)反應(yīng)為宜，然后逐層縫合皮膚。假手術(shù)組僅分離暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)干后逐層縫合；所有手術(shù)操作均由同一人完成。Rsham組和Nsham組大鼠只暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)，然后逐層縫合。

1.3 痛閾測(cè)定：于術(shù)前1d（基礎(chǔ)值，T0），術(shù)后1d（T1）、3d（T2）和7d（T3）測(cè)定大鼠機(jī)械痛閾值和熱痛閾值。參照文獻(xiàn)［3］介紹的方法測(cè)定機(jī)械痛閾。測(cè)定前將大鼠置于底為1cm×1cm鐵絲網(wǎng)的透明有機(jī)玻璃箱內(nèi)適應(yīng)15min后，用von Frey纖維絲（Stoelting醫(yī)療公司，美國）篩網(wǎng)下部垂直刺激大鼠后肢足底中部，持續(xù)時(shí)間≤4s，大鼠出現(xiàn)縮足或舔足行為視為陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。測(cè)定首先從2g刺激開始，當(dāng)該力度的刺激不能引起陽性反應(yīng)，則給予相鄰高一級(jí)力度的刺激；如出現(xiàn)陽性反應(yīng)則給予相鄰低一級(jí)力度的刺激。如此連續(xù)進(jìn)行，直至出現(xiàn)第一次陽性和陰性反應(yīng)的騎跨，再連續(xù)測(cè)定4次，每次刺激間隔30s。采用內(nèi)推法計(jì)算誘發(fā)大鼠出現(xiàn)50%機(jī)械縮足反應(yīng)的刺激力度為機(jī)械痛閾，公式=10 lgX+κδ（X為最后一次刺激力度，κ為不同刺激方式的系數(shù)，在內(nèi)推法的表格中查找，δ為各刺激力度取對(duì)數(shù)后間距的平均值，δ=0.179）。參照文獻(xiàn)［2］介紹的方法測(cè)定熱痛閾。應(yīng)用RTY-1型熱痛刺激儀（第四軍醫(yī)大學(xué)生理教研室研制），將大鼠置于3mm厚的玻璃板上，使用熱輻射光源照射右后肢足底中部，記錄從照射到出現(xiàn)縮足反應(yīng)的時(shí)間，即熱痛閾值。單次照射不超過20s，同一部位刺激的間隔時(shí)間為5min，重復(fù)3次，取其平均值。

1.4 脊髓水平OX-42表達(dá)的測(cè)定：于術(shù)后7d，每組隨機(jī)選取6只大鼠，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40mg/kg）麻醉后，經(jīng)左心室灌注200mL生理鹽水和300mL 4%多聚甲醛溶液，充分固定后，縱向剖開椎管，取L4～5節(jié)段脊髓組織，固定24h，經(jīng)脫水、透明、浸蠟包埋后，切片機(jī)連續(xù)切片厚度為4μm。石蠟切片經(jīng)二甲苯透明，常規(guī)梯度酒精脫蠟，浸入0.01mol/L，pH6.0枸櫞酸鹽溶液中，加熱至98℃進(jìn)行抗原修復(fù)，30min后冷卻至室溫，3%H2O2去離子水室溫孵育20min，正常兔血清封閉液室溫孵育20min。采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)。將切片置入抗OX-42抗體稀釋液（1∶10，Chem icon），室溫孵育24h；生物素標(biāo)記相應(yīng)種屬抗體（1∶200，Sigma，博士德公司分裝），室溫放置2h；生物素-卵白素-辣根過氧化物酶復(fù)合物（1∶500，Sigma，博士德公司分裝），室溫浸泡2h。OX-42陽性產(chǎn)物呈藍(lán)色，位于小膠質(zhì)細(xì)胞胞漿。陰性對(duì)照以0.01mol/L PBS代替抗OX-42抗體液，亦按生物素化酶復(fù)合物法進(jìn)行染色。結(jié)束染色的切片經(jīng)漂洗后脫水、透明，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。應(yīng)用MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)在高倍鏡下（×400）對(duì)脊髓背角淺層進(jìn)行平均灰度分析，每個(gè)脊髓標(biāo)本隨機(jī)選取5張切片，求其灰度的平均值。

1.5 脊髓MCPmRNA和DAFmRNA表達(dá)的測(cè)定：采用RT-PCR法檢測(cè)。取L4～5節(jié)段脊髓背角，用Trizon提取總RNA，紫外分光光度儀測(cè)定RNA濃度。采用Primer premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，MCP上游引物5'-CTATGTTACAGGACCCTTCGT-3'，下游引物5'-CTCTTAGCACCACAGACCACC-3'，擴(kuò)增片段為889bp；DAF上游引物5'-CTGAACGGTGAAGTAGGAGGA-3'，下游引物5'-TCAACTAGCCAGTGAGTAAGAG-3'，擴(kuò)增片段為477bp；PCR反應(yīng)條件95℃預(yù)變性5min后進(jìn)行如下循環(huán)擴(kuò)增，95℃變性1min，53℃復(fù)性2min，72℃延伸1min，共循環(huán)30次。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)和凝膠分析系統(tǒng)進(jìn)行PCR產(chǎn)物掃描和半定量分析，以MCP和DAF的條帶積分光密度值與GAPDH條帶積分光密度值的比值，表示MCPmRNA和DAF mRNA的表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以±s表示，分別采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)資料的方差分析和單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)結(jié)果：坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷后大鼠后肢出現(xiàn)跛行，足呈輕度外翻狀，且有時(shí)出現(xiàn)如舔舐、懸空等后肢保護(hù)現(xiàn)象。各組痛閾值的基礎(chǔ)值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與基礎(chǔ)值比較，Rsham組、Nsham組和RCCI組觀察期間機(jī)械痛閾值和熱痛閾值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與Nsham組相比，NCCI組術(shù)后各觀察時(shí)間點(diǎn)機(jī)械痛閾值和熱痛閾值降低（P＜0.05）；與NCCI組相比，RCCI組大鼠機(jī)械痛閾值和熱痛閾值升高（P＜0.05）。見表1。

2.2 RT-PCR結(jié)果：與Nsham組相比，NCCI組MCPmRNA和DAFmRNA表達(dá)下降（P＜0.05），Rsham組和RCCI組MCPmRNA和DAFmRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與Rsham組相比，RCCI組MCPmRNA和DAFmRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與NCCI組相比，RCCI組MCPmRNA和DAFmRNA表達(dá)升高（P＜0.05）。見表2。

2.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果：Nsham組、Rsham組和RCCI組大鼠OX-42非特異性染色較淺，OX-42陽性細(xì)胞數(shù)量少；NCCI組OX-42染色深，OX-42陽性細(xì)胞數(shù)多。OX-42陽性細(xì)胞平均灰度值測(cè)定結(jié)果顯示，與Nsham組相比，NCCI組OX-42表達(dá)升高（P＜0.05），Rsham組和RCCI組MCPmRNA和DAFmRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與NCCI組相比，RCCI組OX-42表達(dá)降低（P＜0.05）。見表2。

表1 4組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)熱痛閾值和機(jī)械痛閾值的比較Table 1 Com parison ofmechanical and thermal pain threshold in different time points in four groups（n=12，±s）

表1 4組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)熱痛閾值和機(jī)械痛閾值的比較Table 1 Com parison ofmechanical and thermal pain threshold in different time points in four groups（n=12，±s）

*P＜0.05 vs Nshamgroup #P＜0.05 vs NCCIgroup by ANOVA test

Groups Thermal pain threshold（s）T0T1T2T3Mechanical pain threshold（g）T0T1T2T3Nsham18.1±2.5 14.7±1.7 16.6±2.3 17.8±2.2 15.2±1.9 13.5±3.1 13.8±2.8 14.7±2.5 NCCI17.5±1.9 13.8±3.2*11.6±2.1*10.9±3.0*14.8±3.2 7.6±1.9*8.8±2.5*8.2±1.4*Rsham17.7±2.9 14.9±2.2 16.8±1.8 17.4±3.5 15.6±2.0 13.8±1.5 15.4±2.2 15.3±1.7 RCCI17.9±3.6 14.3±2.2 16.1±3.2#16.8±2.7#15.4±3.0 13.2±1.5#15.8±1.5#14.9±2.3#

表2 4組大鼠脊髓背角OX-42陽性細(xì)胞平均灰度值和脊髓組織MCPm RNA、DAFm RNA表達(dá)的比較Table 2 Comparison of OX-42 positive cell，MCPmRNA and DAFm RNA in four groups (n=6，±s）

表2 4組大鼠脊髓背角OX-42陽性細(xì)胞平均灰度值和脊髓組織MCPm RNA、DAFm RNA表達(dá)的比較Table 2 Comparison of OX-42 positive cell，MCPmRNA and DAFm RNA in four groups (n=6，±s）

*P＜0.05 vs Nshamgroup #P＜0.05 vs NCCIgroup by ANOVA test

Groups MCPmRNA DAFmRNA OX-42 positive cell Nsham1.12±0.23 1.15±0.26 155±17 NCCI0.51±0.20*0.49±0.37*179±26*Rsham1.48±0.22 1.52±0.46 154±25 RCCI1.53±0.33#1.49±0.29#157±21#

3 討 論

補(bǔ)體異常活化在許多疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，以補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白為靶標(biāo)抑制補(bǔ)體活化是治療疾病的策略之一［4-8］。大量研究［1，9-10］表明，NPP大鼠脊髓背角發(fā)生補(bǔ)體異常活化，以補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白為靶標(biāo)來治療NPP值得研究。

本研究采用武漢大學(xué)生命科學(xué)院提供的MCP/DAF雙基因重組轉(zhuǎn)染SD大鼠，是利用人補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白基因DAF和MCP整合在轉(zhuǎn)化的SD大鼠神經(jīng)細(xì)胞的染色體上，連續(xù)傳代30次獲得的MCP/DAF雙基因重組轉(zhuǎn)染SD大鼠。RT-PCR測(cè)定顯示，MCP/DAF雙基因重組轉(zhuǎn)染SD大鼠脊髓中MCPmRNA和DAFmRNA表達(dá)顯著高于正常SD大鼠。提示本研究采用的MCP/DAF雙基因重組轉(zhuǎn)染SD大鼠是可靠的。

慢性坐骨神經(jīng)壓迫損傷是研究NPP的經(jīng)典模型，本研究參考文獻(xiàn)采用鉻制羊腸線4道環(huán)形結(jié)扎手段實(shí)現(xiàn)大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷，結(jié)果顯示，損傷側(cè)后爪收攏，不敢著地，熱痛閾值和機(jī)械痛閾值均明顯減低，提示本研究制作的坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷是成功的。OX-42是小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，在靜止?fàn)顟B(tài)下，小膠質(zhì)細(xì)胞很少表達(dá)OX-42，只有在激活狀態(tài)，小膠質(zhì)細(xì)胞大量表達(dá)OX-42，本研究通過觀察OX-42的表達(dá)來了解大鼠脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞的活化情況。

本研究結(jié)果顯示，慢性坐骨神經(jīng)壓迫損傷后，沒有誘發(fā)MCP/DAF雙基因重組轉(zhuǎn)染SD大鼠產(chǎn)生痛覺過敏現(xiàn)象。而正常SD大鼠在慢性坐骨神經(jīng)壓迫損傷后出現(xiàn)明顯的痛覺過敏現(xiàn)象；本研究中還采用免疫組織化學(xué)手段觀察脊髓中小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況，結(jié)果顯示MCP/DAF雙基因重組轉(zhuǎn)染SD大鼠慢性坐骨神經(jīng)壓迫損傷后脊髓背角沒有發(fā)現(xiàn)明顯的小膠質(zhì)細(xì)胞活化，而正常SD大鼠在慢性坐骨神經(jīng)壓迫損傷后出現(xiàn)明顯小膠質(zhì)細(xì)胞活化現(xiàn)象。提示MCP/DAF的表達(dá)改變可影響大鼠遭遇外周神經(jīng)損傷后脊髓中小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，進(jìn)而影響大鼠痛覺過敏的形成。DAF和MCP為膜結(jié)合型補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，它們可阻斷補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)，保護(hù)宿主細(xì)胞免受傷害。NPP大鼠脊髓背角發(fā)生了補(bǔ)體異常活化，活化的補(bǔ)體蛋白不僅激活小膠質(zhì)細(xì)胞，而且影響脊髓背角感覺神經(jīng)元的興奮性，促使神經(jīng)元釋放大量興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，這些興奮性神經(jīng)遞質(zhì)通過突觸間隙作用于突觸后神經(jīng)元，使傷害性信息不斷上傳，經(jīng)過大腦的信息整合，產(chǎn)生痛覺過敏現(xiàn)象［10］。MCP/DAF雙基因重組轉(zhuǎn)染大鼠其MCP/DAF表達(dá)增加，阻斷脊髓背角補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而抑制NPP的形成。

綜上所述，MCP/DAF雙基因重組轉(zhuǎn)染大鼠可抑制外周神經(jīng)損傷引起的痛覺過敏。表明提高脊髓中MCP/DAF的表達(dá)，可在一定程度上對(duì)NPP治療發(fā)揮作用。本研究只是為NPP的治療靶標(biāo)提供新思路，如何治療NPP還有待進(jìn)一步研究。

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（本文編輯：趙麗潔）

EFFECT OF CHRONIC CONSTRICTIVE INJURY TO SCIATIC NERVE ON MCP-DAF TRANSGENIC RAT

WANG Jinbao1，WANG Qi1，ZHU Haijuan1，CAIZenghua1，WANG Yuan2
(1.Department of Anesthesiology，Bethune International Peace Hospital of PLA，Shijiazhuang 050082，China；
2.Department of Infection Control，the Fourth Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang 050011，China）

ObjectiveTo investigate the effect of chronic constrictive injury（CCI）to sciatic nerve on the behavior of MCP-DAF transgenic rats，and to find a new way to treat neuropathic pain（NPP）.MethodsTwenty-four MCP-DAF transgenic SD rats weighting 200-250kg were randomly divided into two groups（n=12）Rshamgroup and RCCIgroup，while twenty-four adult male SD rats weighting 200-250kg were randomly divided into two groups（n=12）：Nshamgroup and NCCIgroup. Sciatic nerve on one side was exposed and 4 loose ligatures were placed on the sciatic nerve at 1 mm intervalswith 4-0 catgut in rat in NCCIgroup and RCCIgroup.Mechanical and thermal pain threshold were measured by paw withdrawal latencies to von frey hair and radiant heat stimulation at1 d before operation（baseline）and 1，3，7 d after operation.The animals were killed at 7 d after operation and the L4-5segment of the spinal cord was removed for determination of expression of membrane cofactor protein（MCP）mRNA and decay accelerating facto（r DAF）mRNA（by reverse-transcription PCR［RT-PCR］）and OX-42（by immuno-histochemistry）.Resultscompared with Nshamgroup，the pain threshold was significantly decreased in NCCIgroup and no obvious change in rats in Rshamgroup and RCCIgroup；the expression of MCP mRNA and DAF mRNA were significantly decreased in spinal cord in rats in NCCIgroup，and were increased in Rshamgroup and RCCIgroup；the expression of OX-42 in spinal cord was obviously increased in rats in NCCIgroup，but had no significant change in Rshamgroup and RCCIgroup. Conclusion The hyperalgesia was not induced by chronic constrictive injury to sciatic nerve in MCPDAF transgenic rats，which can offer a new way to treat the NPP.

sciatic neuropathy；pain threshold；rats

R735.7

A

1007-3205（2013）09-0997-04

2013-02-25；

2013-04-17

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30772077），河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2010001881）

王金保（1974-），男，河南衛(wèi)輝人，中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事神經(jīng)病理學(xué)疼痛發(fā)病機(jī)制研究

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.09.003