酶與微波處理對海帶多糖提取及抗氧化活性的影響

何傳波，魏好程，熊何健，湯鳳霞，吳國宏

(集美大學生物工程學院，福建 廈門 361021)

酶與微波處理對海帶多糖提取及抗氧化活性的影響

何傳波，魏好程，熊何健，湯鳳霞，吳國宏

(集美大學生物工程學院，福建 廈門 361021)

采用纖維素酶解和微波輔助方法從海帶中提取多糖組分，以羥自由基和DPPH自由基清除率為衡量抗氧化活性的指標，考察不同提取方法對海帶多糖抗氧化活性的影響。單因素試驗考察酶用量、酶解時間、微波萃取溫度和時間對多糖提取率的影響。酶解方法的最佳提取條件為：酶用量1.5%、溫度40℃、pH5、時間2.5h，多糖提取率為3.46%。抗氧化活性實驗表明，海帶多糖對DPPH自由基和羥自由基有較好地清除效果，其清除能力與多糖質量濃度有明顯的量效關系；酶解和微波處理得到的海帶多糖樣品比常規水浴浸提的樣品抗氧化活性有所提高；隨著酶用量的增加和微波萃取時間的延長，抗氧化活性呈現下降趨勢。

海帶；多糖；酶解；微波；抗氧化活性

海帶，別名江白菜，中藥名稱“昆布”，是一種具食用和藥用價值的大型海藻，隸屬于褐藻門。它富含蛋白質、脂肪、碳水化合物等宏量營養素以及碘、鈣、磷、鐵、胡蘿卜素、B族維生素等多種微量元素，其顯著的藥用價值在《本草綱目》、《食用本草》、《中國中草藥匯編》等醫書中均有記載[1]。

糖類是除蛋白質、核酸以外的一類重要的生物大分子，來源于動植物、藻類的多糖由于它們獨特的功能和低毒性，在保健食品和藥品發展方面具有廣闊的應用前景。海帶多糖(Laminaria japonica polysaccharides，LJPs)是存在于海帶細胞間和細胞內的一類天然生物大分子物質，研究表明，海帶對外界惡劣環境所表現出來的抗逆耐受能力與它們所含的海帶多糖有直接關系，同時，海帶多糖還具有穩定細胞膜和蛋白質結構的功能[2-3]。另外，許多文獻報道證實，從海帶中分離出的多糖具有抗癌、防癌和增強免疫等功能，而且在抗病毒、降血糖、降血脂、抗凝血和減肥等方面具有特殊功效[4-8]。

我國海帶的產量和養殖量居亞洲之最，年產約23萬噸干品，在我國福建、遼寧、山東、浙江及廣東省北部沿海均有養殖[9-10]。目前，除少部分深加工外，大部分以粗加工干制品為主，我國海帶深加工制品具有很大的發展潛力。因此，研究開發海帶多糖，促進我國海帶產品深加工利用，變海帶資源優勢為經濟優勢，具有重要意義。

常規多糖提取采用水提醇沉的方法，具有能耗高、提取率低等缺點，酶工程技術和微波輔助浸提技術是近年來發展起來的新型的破壁提取方法，與傳統方法相比具有節能、快速、條件溫和、提取效率高等優點，已廣泛用于植物有效成分的提取[11]。本實驗以干海帶為原料，分別采用纖維素酶法和微波輔助的方法提取其中的多糖組分，以羥自由基(·OH)和DPPH自由基清除率為衡量抗氧化活性指標，探討不同的提取方法對自由基清除活性的影響，為海帶資源的綜合利用和精深加工提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

市售干海帶，粉碎待用。

纖維素酶(酶活力≥15U/mg) 國藥集團化學試劑有限公司；DPPH自由基 美國Sigma 公司；三(羥甲基)胺基甲烷(生化試劑) 中國醫藥集團；鄰苯三酚、鄰二氮菲、鹽酸、過氧化氫、硫酸亞鐵、無水乙醇等試劑如無特殊說明均為分析純。

MDS-6微波消解/萃取儀 上海新儀微波化學科技有限公司；DKZ電熱恒溫振蕩水槽 上海實驗儀器廠；WK-200B高速藥物粉碎機 青州市精誠機械有限公司；723PC可見分光光度計 上海欣茂儀器有限公司；BS/ BT電子天平 德國賽多利斯股份公司；RE-52AA旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；TDL-5離心機 上海安亭科學儀器廠；3K3D高速冷凍離心機 德國Sigma公司；pH211臺式酸度測定儀 北京哈納科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 海帶多糖的提取

將干海帶粉碎過篩，經乙醚回流脫酯后，熱水浸提，抽濾，合并濾液，減壓濃縮，加入5倍體積的95%乙醇沉淀，低溫靜置過夜，離心(轉速4000r/min)，沉淀加蒸餾水溶解，再次重復乙醇沉淀的步驟兩次，最后1次得到的沉淀用少量水溶解，活性炭脫色后，Sevag法脫蛋白4次，濃縮，冷凍干燥，得到海帶多糖。

1.2.2 粗多糖提取率的計算

多糖含量測定：苯酚-硫酸法[12]。

粗多糖提取率以1g干品中提取出來的粗多糖總量的百分含量表示，計算方法如式(1)所示：

式中：0.9為葡萄糖的換算系數。

1.2.3 ·OH清除率測定方法

取0.75mmol/L鄰二氮菲溶液1mL，PBS液2mL和蒸餾水1mL，充分混勻后，加0.75mmol/L硫酸亞鐵1mL混勻，加0.01%的過氧化氫1mL，37℃條件下保溫60min，于536nm波長處測其吸光度，其值(Ap)，用30%的乙醇1mL代替1mL過氧化氫，測得吸光度為(Ag)。再用試樣1mL代替1mL蒸餾水，測得吸光度為(As)。

1.2.4 DPPH自由基的清除率測定方法

稱取20mg的DPPH用無水乙醇溶解定容于500mL容量瓶中。分為樣品組、對照組和空白組。不同的樣品液充分混勻，靜置30min后在517nm波長處測定吸光度。DPPH自由基清除率按式(3)計算：

DPPH自由基清除率/%=[1－(A2－A1)/A0]×100 (3)

式中：A0為2mL DPPH溶液＋2mL溶劑的吸光度；A1為2mL乙醇＋2mL樣品溶液的吸光度；A2為2mL DPPH溶液＋2mL樣品溶液的吸光度。

2 結果與分析

2.1 酶解方法對多糖提取率的影響

2.1.1 酶用量對多糖提取率的影響

圖1 酶用量對海帶多糖提取率的影響Fig.1 Effect of enzyme amount on the yield of polysaccharides

纖維素酶用量在0～4.0%之間變化，控制料液比1:40、溫度50℃、pH5、提取2h后，立即置90℃水浴加熱滅酶10min，得到的多糖提取率如圖1所示。纖維素酶的使用可以明顯增加海帶多糖的提取率，酶用量在0～1.5%之間，多糖提取率迅速增加，當酶用量達到1.5%時，多糖提取率為2.57%，與常規水浴浸提法比較，提取溫度顯著降低，提取率明顯增加(水浴浸提溫度90℃，2h時多糖提取率僅為1.8%)。這主要是由于在溶劑作用下，纖維素酶進入細胞壁內部并將其溶脹酶解后，多糖更容易被溶出，并且隨著酶用量的增加，酶與纖維素分子的接觸機會增加，更多的多糖溶出[13]。當酶用量超過1.5%后，多糖提取率增加趨勢變緩，這主要是由于底物纖維素完全被酶分子所飽和，酶作用的速度趨于穩定，致使多糖溶出量也趨于穩定。

2.1.2 酶解時間對多糖提取率的影響

固定其他條件不變，酶用量為1.5%，提取時間在0.5～3h之間變化，得到的多糖提取率如圖2所示。在提取時間小于2h時，多糖提取率隨著時間的延長而逐漸增加，當超過2h后，提取率基本不變。由于酶與底物的結合需要一定的時間，反應時間太短，酶解不充分，因此，在前期增加酶解時間可以使纖維素酶對細胞壁中的纖維素物質充分酶解，增加多糖溶出率。但酶解時間過長，酶的催化活性降低，溶劑中多糖的濃度越來越高，濃度差變小，擴散速度減慢，基本達到平衡后，多糖的提取率便不再明顯增加[14]。并且，由于纖維素酶并不是專一性高的酶，酶解時間的延長，可能會造成多糖物質的降解。

圖2 酶解時間對海帶多糖提取率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis time on the yield of polysaccharides

2.1.3 酶法提取的正交試驗

表1 纖維素酶法提取的正交試驗設計與結果Table1 Orthogonal array design and results for the optimization of cellulase-catalyzed hydrolysis

根據單因素試驗結果，結合纖維素酶的最適溫度和pH值范圍，選取酶用量、時間、溫度和pH值4個因素，各取3個水平，選用L9(34)的正交表，以多糖提取率為考察指標，對酶法提取多糖的工藝條件進行優化，并對結果進行極差分析及方差分析，確定最適作用條件，正交試驗設計與結果見表1。極差分析表明，各因素對提取率的影響主次順序是C(pH值)＞A(溫度)＞D(時間)＞B(加酶量)。隨酶處理時間的延長，多糖提取率逐漸升高，酶用量、溫度和pH值對多糖提取率的影響趨勢相同，均是先增后降。得到的最優提取條件為：A2B2C2D3，即：酶用量1.5%、溫度40℃、pH5、時間2.5h。采用此條件進行3次驗證實驗，得到的平均提取率為3.46%。

2.2 微波萃取方法對多糖提取率的影響

2.2.1 微波萃取溫度對多糖提取率的影響

微波萃取主要是通過穿透水將能量傳遞到纖維素細胞內部微管束和腺細胞內，細胞內溫度突然升高，連續的高溫使其內部壓力超過細胞空間膨脹的能力，從而導致細胞破裂，細胞內的物質自由流出，傳遞到周圍被溶解。微波熱效應是其破壁的最根本原因[15]，因此，本實驗研究了微波條件下，不同萃取溫度對多糖提取率的影響。微波萃取溫度從30～90℃之間變化，得到海帶多糖提取率如圖3所示。

圖3 微波萃取溫度對海帶多糖提取率的影響Fig.3 Effect of microwave extraction temperature on the yield of polysaccharides

由Stokes-Einstein公式：DAB=KT/6πμr，可以看出，溫度與擴散系數正相關，因此要想獲得較高的擴散速率，就必須設法升高提取溫度。從圖3可以看出，隨著微波作用溫度從30～80℃，物料在單位時間內獲得的能量逐步增加，加劇了海帶纖維素細胞的破裂和組織中多糖物質分子及萃取溶劑分子的熱運動，多糖類化合物的溶出與溶劑向組織內的滲入相互促進，使兩者有更充分接觸的機會，從而使多糖提取率明顯增加。但是超過80℃后，提取率逐漸降低，這可能是由于當微波溫度太高時，微波對細胞內物質的選擇性加熱的性能差異減少，一些易溶于水的其他物質先被溶解，造成多糖得率降低[16]。同時，局部溫度過高可能會導致多糖類化合物的分解。

2.2.2 微波萃取時間對多糖提取率的影響

固定其他條件不變，微波萃取時間從0.5～4h之間變化，得到多糖提提取率如圖4所示。隨著時間的延長，多糖的提取率逐漸增大，其中在0.5～1.5h內，海帶多糖提取率增長速度較快，微波萃取0.5h的多糖提取率就已經達到了2.20%，超過了常規水浴方法的提取率。1.5h后再延長時間，多糖的提取率基本不變。微波加熱可使水等極性分子在微波電磁場中快速轉向及定向排列，從而產生撕裂和相互摩擦發熱，正是這種劇烈運動導致植物細胞內部結構發生破壞，有助于多糖成分的溶出，從而大大縮短提取時間[14]。微波處理時間的延長可以增加極性溶劑分子間的摩擦，使其對植物細胞內部結構的破壞程度加劇。但是微波處理時間也不能過長，過長就會導致水分蒸發過快，從而使得細胞內多糖的提取難以進行，并且也可能導致多糖活性的降低。

圖4 微波萃取時間對海帶多糖提取率的影響Fig.4 Effect of microwave treatment time on the yield of polysaccharides

2.3 不同提取方法對抗氧化活性的影響

圖5 海帶多糖對DPPH自由基的清除活性Fig.5 Scavenging effect of LJPs on DPPH radical

圖6 海帶多糖對?OH的清除活性Fig.6 Scavenging effect of LJPs on hydroxyl radical

比較常規水浴浸提、酶解提取(酶用量分別為1%和4%)、微波萃取(微波萃取時間分別為1h和4h)等不同方法獲得的海帶多糖樣品對?OH和DPPH自由基的清除活性，考察酶與微波處理對多糖抗氧化活性的影響。以多糖質量濃度為橫坐標，兩種自由基清除率為縱坐標，各得到5條曲線如圖5、6所示，對照組為不同質量濃度的VC溶液。結果顯示，海帶多糖具有較好的清除DPPH自由基和·OH效果，并且隨著多糖質量濃度的增加，清除率逐漸增強，清除能力與其質量濃度具有明顯的量效關系，在實驗質量濃度范圍內，海帶多糖對兩種自由基的最大清除率可達到60%左右。有文獻[17-18]報道，海帶多糖的抗氧化機理可能是氧自由基先將糖鏈上的糖醛酸部分氧化降解，然后再將糖鏈上甘露糖、半乳糖和葡萄糖形成的糖苷鍵切斷，從而將海帶硫酸多糖降解。因此，海帶多糖在體外對自由基有一定的清除作用，作為功效成分應用于功能性食品，可能清除體內產生的過多自由基，阻斷體內自由基鏈式反應的進行，具有天然抗氧化劑的應用價值。

根據樣品清除自由基的曲線方程分別計算IC50值，結果見表2。可知，海帶多糖對兩種自由基的清除活性明顯低于VC對照組，不同的海帶多糖樣品對兩種自由基的清除活性由強到弱依次為：酶用量1%＞酶用量4%＞微波萃取1h＞微波萃取4h＞常規水浴浸提。酶解和微波處理可能會對多糖的結構產生破壞而導致其生物活性降低，在本實驗中，由于酶解方法大大降低了提取溫度，微波萃取顯著縮短了提取時間，使得酶與微波處理對多糖結構的影響遠小于長時間、高溫浸提對結構的破壞，從而導致其抗氧化活性并沒有降低。同時，表2數據還顯示，隨著酶用量的增加和微波萃取時間的延長，其抗氧化活性呈現下降趨勢。這提示，在應用這兩種方法時，應當注意處理程度，適當的酶用量和微波處理時間，不僅可以顯著提高多糖得率，而且還能最大限度保持其生物活性。

表2 海帶多糖清除自由基的IC5500Table 22 IICC5500values for free radical scavenging by LJPs

3 結 論

3.1 本實驗采用酶解和微波方法提取海帶中的多糖組分，并通過DPPH自由基和?OH清除活性考察不同方法對其體外抗氧化活性的影響。實驗結果證實，與常規多糖提取方法相比，酶解方法能有效降低提取溫度，微波萃取方法能明顯縮短提取時間，這兩種方法均具有節能、提取效率高等的優點。并且，適當的酶與微波處理不會降低其抗氧化活性，是值得大規模開發利用的多糖提取新技術。

3.2 單因素試驗表明，海帶多糖提取率隨酶用量、酶解時間、微波萃取時間的變化趨勢相似，均是先升高然后持平，隨微波萃取溫度升高先升后降。正交優化試驗確定的最佳酶法提取工藝條件為：酶用量1.5%、溫度40℃、pH5、時間2.5h，多糖提取率為3.46%。

3.3 抗氧化活性結果表明，海帶多糖對DPPH自由基和?OH有較好的清除效果，其清除能力與多糖質量濃度有明顯的量效關系；酶解和微波萃取方法由于降低了提取溫度、縮短了提取時間，得到的海帶多糖樣品比常規水浴浸提樣品活性高；隨著酶用量和微波萃取時間的增加，抗氧化活性呈現下降趨勢。

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Extraction and Antioxidant Activities of Polysaccharides from Laminaria japonica as Affected by Enzymatic Hydrolysis and Microwave

HE Chuan-bo，WEI Hao-cheng，XIONG He-jian，TANG Feng-xia，WU Guo-hong
(School of Bioengineering, Jimei University, Xiamen 361021, China)

The effects of cellulase-catalyzed hydrolysis and microwave treatment, separately used to enhance the extraction of polysaccharides from Laminaria japonica polysaccharides (LJPs) on the free radical scavenging activity of LJPs against hydroxyl and DPPH radicals were investigated. One-factor-at-a-time designs were use to examine the effect of enzyme dosage and hydrolysis time as well as ultrasonic-assisted extraction temperature and time on the yield of LJPs. The optimum cellulase-assisted extraction conditions were found to be 1.5%, 40 ℃, 5 and 2.5 h for enzyme dosage, temperature, pH and time, respectively. Antioxidant assays showed that LJPs possessed good radical scavenging activity against hydroxyl and DPPH radicals in a marked dose-dependent manner. Polysaccharides with stronger antioxidant activity were obtained by microwave-assisted extraction and cellulase-assisted extraction compared with the conventional method of waterbath extraction. Furthermore, higher enzyme dosages and prolonged microwave treatment reduced the antioxidant activity of LJPs.

Laminaria japonica polysaccharides (LJPs)；enzyme hydrolysis；microwave；antioxidant activities

Q814.9

A

1002-6630(2013)18-0051-05

10.7506/spkx1002-6630-201318011

2013-04-09

福建省自然科學基金項目(2010J05028)；李尚大集美大學學科建設基金項目(ZC2012007)

何傳波(1978—)，男，副教授，博士，研究方向為多糖物質及其綜合利用。E-mail：hcbcc@jmu.edu.cn