高效液相色譜法檢測(cè)醬油中NaFeEDTA

狄 蕊，霍軍生*，魏 峰，黃 建，孫 靜

(1.黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，安徽 黃山 245041；2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與食品安全所，北京 100050)

高效液相色譜法檢測(cè)醬油中NaFeEDTA

狄 蕊1，霍軍生2,*，魏 峰1，黃 建2，孫 靜2

(1.黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，安徽 黃山 245041；2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與食品安全所，北京 100050)

采用四丁基氫氧化銨為離子對(duì)試劑，以C18色譜柱為固定相，建立檢測(cè)醬油中乙二胺四乙酸鐵鈉(NaFeEDTA)的高效液相色譜法。結(jié)果表明：當(dāng)NaFeEDTA的添加量為2.00g/L時(shí)，在10種不同品牌醬油中的回收率為94.1%～101.5%，平均回收率為97.7%，測(cè)量結(jié)果與國(guó)標(biāo)方法沒有顯著差異(P＞0.05)。本方法具有通用性好的優(yōu)點(diǎn)，可用于鐵強(qiáng)化醬油中NaFeEDTA的檢測(cè)。

醬油；乙二胺四乙酸鐵鈉；四丁基氫氧化銨；C18色譜柱

絡(luò)合型營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑NaFeEDTA生物利用率較高[1-3]，而且對(duì)食物的感官影響小[4-5]。其在我國(guó)1999年被批準(zhǔn)為鐵營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑；2002年被批準(zhǔn)在醬油中使用[6-7]。食品中NaFeEDTA的檢測(cè)研究，對(duì)食品生產(chǎn)質(zhì)量控制和強(qiáng)化食品的推廣、市場(chǎng)監(jiān)督等都具有重要的意義。

食品中鐵元素的檢測(cè)方法如原子吸收法[8]、原子發(fā)射光譜法[9]、質(zhì)譜法[10]、溶出伏安法[11]等，無法對(duì)NaFeEDTA和焦磷酸鐵、硫酸亞鐵等各種鐵強(qiáng)化劑進(jìn)行區(qū)分，因此不能用于對(duì)NaFeEDTA的直接檢測(cè)。NaFeEDTA是Fe3+與EDTA所形成絡(luò)合物的鈉鹽，在中性和弱酸性溶液中通常以Na+和FeEDTA-形式存在[12]。魏峰等[13]于2006年建立了醬油中NaFeEDTA的高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)檢測(cè)方法，該方法已經(jīng)被GB/T 21234—2007《鐵強(qiáng)化醬油中乙二胺四乙酸鐵鈉的測(cè)定》[14]所采納，該標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布極大地規(guī)范和方便了NaFeEDTA的檢測(cè)。但該方法在使用過程中存在一些問題。比如，該方法使用C8色譜柱作為固定相，而一般的檢測(cè)機(jī)構(gòu)和食品檢測(cè)方法通常使用的是C18色譜柱，這樣需另行購(gòu)買色譜柱。此外，在原來的方法文獻(xiàn)中沒有對(duì)所用的離子對(duì)試劑的種類進(jìn)行考察。針對(duì)上述問題以及國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)修訂的需要，本實(shí)驗(yàn)將以C18色譜柱為固定相，對(duì)分離醬油中NaFeEDTA的色譜條件和干擾因素進(jìn)行研究，以期建立更加通用的NaFeEDTA檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

10種品牌醬油 市售。

NaFeEDTA試劑、40%四丁基氫氧化銨溶液 美國(guó)Sigma公司；甲醇為色譜純；鹽酸、NaOH為優(yōu)級(jí)純；甲酸、四丁基溴化銨、十六烷基三甲基溴化銨均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水(18.2MΩ?cm)。

200型高效液相色譜分析儀(配有DAD紫外檢測(cè)器)美國(guó)安捷倫科技公司；PHS-3C精密酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

準(zhǔn)確稱取NaFeEDTA試劑200mg，用水溶解、移至100mL容量瓶，定容，制成質(zhì)量濃度為2000mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，備用。

吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液2.50mL置于50mL容量瓶中，用75%甲醇溶液定容；再分別吸取該溶液1.0～10.0mL分別置于50mL容量瓶中，用水定容，搖勻，制得質(zhì)量濃度為2～20mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，避光保存。

1.2.2 樣品處理

吸取醬油樣品2.5mL置于50mL容量瓶，用75%甲醇溶液定容，搖勻。將該溶液避光靜置50min后，過濾，吸取續(xù)濾液5.00mL置于50mL的容量瓶中，用水定容[10]，色譜進(jìn)樣前用0.45μm濾膜過濾。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax XDB-C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)。

流動(dòng)相溶液：移取TBAOH溶液3.0mL于燒杯中，加水200mL，用甲酸調(diào)pH值至3.0后，移至1000mL容量瓶，加120mL甲醇，用水稀釋至刻度，搖勻。

流動(dòng)相流速：1.00mL/min；柱溫：25℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；進(jìn)樣量：20μL；樣品色譜分析時(shí)間：15min。

2 結(jié)果與分析

2.1 離子對(duì)試劑的選擇

用液相色譜分析陰離子時(shí)，常用季銨鹽作為離子對(duì)試劑[15-16]，其與固定相的吸附能力和與組分陰離子的結(jié)合能力都會(huì)對(duì)分離產(chǎn)生影響。在實(shí)驗(yàn)中采用C18色譜柱作為固定相，在相同質(zhì)量濃度和pH值條件下比較了十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、四丁基溴化銨(TBAB)和四丁基氫氧化銨(TBAOH)對(duì)FeEDTA-的分離效果。結(jié)果，在pH值為3.0的甲酸緩沖液中使用1.3g/L的CTAB作離子對(duì)試劑時(shí)，F(xiàn)eEDTA-的色譜峰較寬(保留時(shí)間為6.5min時(shí)，峰寬為0.8min)，理論塔板數(shù)僅為1060，分離效果差；而且FeEDTA-的出峰時(shí)間不穩(wěn)定，隨著流動(dòng)相沖洗色譜柱時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)eEDTA-的出峰時(shí)間也逐漸延長(zhǎng)，出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是因?yàn)镃TAB在固定相上的吸附平衡需要較長(zhǎng)時(shí)間才能達(dá)到，CTAB在固定相上的質(zhì)量濃度逐漸增加，從而引起組分的保留時(shí)間延長(zhǎng)。因此無法用CTAB作為離子對(duì)試劑。

離子對(duì)色譜法中流動(dòng)相的離子強(qiáng)度，會(huì)對(duì)組分的保留值產(chǎn)生巨大影響。流動(dòng)相中離子強(qiáng)度增加，陰離子增多會(huì)與組分產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，從而減小FeEDTA-的保留值。在流動(dòng)相pH值為3.0的條件下以質(zhì)量濃度為1.2g/L的TBAOH為離子對(duì)試劑，用甲酸調(diào)節(jié)pH值至3.0，F(xiàn)eEDTA-的保留時(shí)間為9.1min；而在相同條件下以TBAB作為離子對(duì)試劑，F(xiàn)eEDTA-的保留時(shí)間僅為5.7min。這應(yīng)該是由于使用TBAB的流動(dòng)相的離子強(qiáng)度大引起的。醬油中的有機(jī)酸等雜質(zhì)，保留時(shí)間較短，如果使用TBAB，雜質(zhì)可能會(huì)對(duì)FeEDTA-產(chǎn)生干擾，因此本實(shí)驗(yàn)選用TBAOH作為離子對(duì)試劑。

圖1 流動(dòng)相中TBAOH含量對(duì)保留時(shí)間的影響Fig.1 Effect of TBAOH content on the retention time of NaFeEDTA

流動(dòng)相中TBAOH的質(zhì)量濃度對(duì)組分的保留時(shí)間有顯著影響。如圖1所示，以pH3.0含12%甲醇的甲酸緩沖溶液作為流動(dòng)相時(shí)，隨著離子對(duì)試劑質(zhì)量濃度的增加，組分的保留時(shí)間縮短，這與Lucena等[17]的報(bào)道基本一致。當(dāng)離子對(duì)試劑的質(zhì)量濃度增大時(shí)，離子強(qiáng)度也相應(yīng)增大，流動(dòng)相中陰離子對(duì)樣品陰離子與離子對(duì)試劑結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)作用增強(qiáng)，因此組分的保留時(shí)間縮短。

2.2 甲醇含量的選擇

本實(shí)驗(yàn)以緩沖鹽溶液-甲醇混合體系作為流動(dòng)相，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲醇含量在10%～14%時(shí)，均可取得比較滿意的分離效果。如果甲醇含量小于10%，則被測(cè)組分的保留時(shí)間將大于10min，且醬油中某些雜質(zhì)的保留時(shí)間將大于20min，分析時(shí)間過長(zhǎng)。而增加甲醇的比例，流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度增加，被測(cè)組分和雜質(zhì)的保留時(shí)間減少。這樣不僅可以縮短分析時(shí)間，還可以改善組分的峰形，但甲醇濃度過大，會(huì)因被測(cè)組分與前面的雜質(zhì)峰的分離度減小，引起組分出峰時(shí)間處的基線噪音波動(dòng)增大。因此本實(shí)驗(yàn)最終選擇甲醇含量12%的流動(dòng)相。

2.3 流動(dòng)相pH值的選擇

在中性條件下，有部分FeEDTA-在流動(dòng)相中發(fā)生水解反應(yīng)以陰離子FeEDTAOH2-的形式存在[18]，引起組分的保留性質(zhì)發(fā)生變化。因此，NaFeEDTA的分離需要在酸性條件下進(jìn)行。醬油樣品中的一些氨基酸，可能會(huì)對(duì)NaFeEDTA的測(cè)定產(chǎn)生干擾。而在pH值小于其等電點(diǎn)時(shí)，氨基酸和多肽以陽(yáng)離子形式存在，幾乎不被固定相保留。而FeEDTA-因?yàn)殡x子對(duì)試劑的存在，保留時(shí)間延長(zhǎng)。流動(dòng)相pH值降低會(huì)使氨基酸的干擾減小。從圖2可以看出，某品牌老抽醬油樣品在pH3.0時(shí)保留時(shí)間5min以后的雜質(zhì)色譜峰比pH4.0、pH5.0時(shí)少得多。因此本實(shí)驗(yàn)最終確定流動(dòng)相的pH值為3.0。

圖2 老抽醬油在不同pH值時(shí)的色譜圖Fig.2 Chromatograms of dark soy sauce of different pH values

2.4 固定相的選擇

圖3 NaFeEDTAA在CC8和CC1188固定相上的色譜圖Fig.3 Chromatograms of NaFeEDTA on C8and C18columns

圖3 為NaFeEDTA在C8和C18固定相上的色譜圖。十八烷基鍵合硅膠即C18固定相，比C8的碳鏈更長(zhǎng)，極性較C8的極性小，但二者的保留性質(zhì)比較相似，一般能用C8分析的物質(zhì)，在C18上也能分離。而采用離子對(duì)色譜時(shí)，固定相的差異會(huì)影響與離子對(duì)試劑的吸附能力，從而影響組分的保留值。本研究采用上述優(yōu)化的流動(dòng)相條件，比較了150mm和250mm兩種C18色譜柱(5μm)，發(fā)現(xiàn)FeEDTA-在150mm色譜柱上的保留時(shí)間較短，與前面出峰的大量干擾物的保留時(shí)間相近；減少流動(dòng)相的離子強(qiáng)度和離子對(duì)試劑質(zhì)量濃度后，分離效果仍然較差。使用250mm C18色譜柱，在優(yōu)化的流動(dòng)相條件下對(duì)NaFeEDTA的有效塔板數(shù)為1438，理論塔板數(shù)為2235；而在相同儀器上采用C8色譜柱的國(guó)標(biāo)方法的有效塔板數(shù)為1936，理論塔板數(shù)為2666。從此可以看出采用C8柱可以獲得最佳的分離效果，但采用C18色譜柱也可以進(jìn)行分離。

2.5 干擾實(shí)驗(yàn)

圖4為添加了NaFeEDTA的(添加量2.00g/L)某品牌原汁醬油以C18柱為固定相在優(yōu)化條件下的色譜圖。苯甲酸鈉、山梨酸鉀為食品中常用的防腐劑，GB 2760—2011《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定[19]，兩者在醬油中的添加量應(yīng)小于1.0g/L。而醬油中常見的有機(jī)酸有甲酸、乙酸、檸檬酸等[20]。這些物質(zhì)若以陰離子形式存在可能會(huì)對(duì)NaFeEDTA的分離產(chǎn)生干擾，本研究在錦珍醬油和草菇老抽醬油中分別加入苯甲酸鈉、山梨酸鉀、檸檬酸三鈉(添加量為1.0g/L)，分別使用國(guó)標(biāo)方法(C8柱)和本實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化方法(C18柱)進(jìn)行色譜分析。結(jié)果這兩種方法在色譜圖中NaFeEDTA的出峰時(shí)間處，均沒有發(fā)現(xiàn)干擾峰，對(duì)市售10種未添加NaFeEDTA的醬油進(jìn)行色譜檢測(cè)，結(jié)果兩種方法在FeEDTA-的保留時(shí)間處也均沒有干擾峰。因此可判斷使用C8柱和C18柱，醬油中的常見雜質(zhì)，均不會(huì)產(chǎn)生干擾。

圖4 添加NaFeEDTA的原汁醬油色譜圖Fig.4 Chromatogram of original soy sauce with spiked NaFeEDTA

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)，峰面積(mAU)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A=2.48×104C。NaFeEDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度在2～20mg/L范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.9998，線性關(guān)系良好。與國(guó)標(biāo)法相比，相同質(zhì)量濃度NaFeEDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積基本一致，靈敏度相同。NaFeEDTA溶液的最低檢測(cè)限為0.4mg/L(RSN=3)。

2.7 樣品測(cè)定

表1 不同品牌醬油中NaFeEDTA的回收率測(cè)定結(jié)果Table1 Recovery rates of NaFeEDTA in different soy sauce products

不同醬油的成分存在較大差異，本實(shí)驗(yàn)在市場(chǎng)上購(gòu)買了10種不同品牌未添加NaFeEDTA的醬油，將一定量NaFeEDTA試劑加入其中，攪拌溶解后制成鐵強(qiáng)化醬油，采用本方法和國(guó)標(biāo)方法分別進(jìn)行回收率測(cè)定，結(jié)果見表1。采用本方法測(cè)試的不同品牌的醬油的回收率在94.1%～101.5%之間，平均回收率為97.7%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.04%。本方法在實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)同一樣品重復(fù)測(cè)定(n=6)的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.93%。采用國(guó)標(biāo)方法的回收率為95.1%～104.7%，平均回收率為98.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.3%。兩種方法的測(cè)量結(jié)果沒有顯著差異(P＞0.05)，說明兩種方法皆可用于醬油中NaFeEDTA的測(cè)定。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用高效液相色譜考察了色譜條件對(duì)鐵強(qiáng)化醬油樣品中NaFeEDTA測(cè)定的影響。結(jié)果表明，利用TBAOH作為離子對(duì)試劑，采用C18色譜柱，可以得到滿意的分離效果。NaFeEDTA標(biāo)準(zhǔn)曲線在2～20mg/L范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)為0.9998。NaFeEDTA溶液的檢出限為0.4mg/L(RSN=3)。對(duì)同一樣品重復(fù)測(cè)定(n=6)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.93%。本方法通用性好，樣品測(cè)定平均回收率為97.7%，與現(xiàn)行國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)結(jié)果一致，可以用于對(duì)鐵強(qiáng)化醬油中NaFeEDTA的測(cè)定。

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Determination of NaFeEDTA in Soy Sauce by HPLC

DI Rui1，HUO Jun-sheng2,*，WEI Feng1，HUANG Jian2，SUN Jing2
(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Huangshan University, Huangshan 245041, China；2. Institute of Nutrition and Food Safety, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100050, China)

An HPLC method was developed for the determination of sodium iron ethylenediaminetetraacetate (NaFeEDTA) in soy sauce on a C18column with tetrabutylammonium hydroxide as ion-pair reagent in the mobile phase. In 10 different kinds of soy sauce, at the spiked level of 2.00 g/L, the recovery rates of NaFeEDTA were in the range of 94.1%–101.5%, with an average of 97.7%. The measurement results had no significant difference with those obtained by the national standard method (P ＞ 0.05). This method with good versatility can be used for the determination of NaFeEDTA in soy sauce.

soy sauce；NaFeEDTA；tetrabutylammonium hydroxide；C18column

O657.7

A

1002-6630(2013)18-0150-04

10.7506/spkx1002-6630-201318030

2012-08-27

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2010AA023004)；黃山學(xué)院科學(xué)研究項(xiàng)目(2006xkjq009)

狄蕊(1979—)，女，講師，碩士，研究方向?yàn)榉治龌瘜W(xué)。E-mail：keania@126.com

*通信作者：霍軍生(1963—)，男，研究員，博士，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)。E-mail：jhuang@263.net