高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定蜂王漿中氟胺氰菊酯、三唑醇和蠅毒磷殘留

周 萍，李英華，胡福良*，趙 煥，吳 捷，梁世君

(1.杭州蜂之語蜂業(yè)股份有限公司，浙江 桐廬 311500；2.浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術學院，浙江 杭州 310018；3.浙江大學動物科學學院，浙江 杭州 310029；4.桐廬縣質(zhì)量計量監(jiān)測中心，浙江 杭州 311500)

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定蜂王漿中氟胺氰菊酯、三唑醇和蠅毒磷殘留

周 萍1，李英華2，胡福良3,*，趙 煥1，吳 捷4，梁世君4

(1.杭州蜂之語蜂業(yè)股份有限公司，浙江 桐廬 311500；2.浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術學院，浙江 杭州 310018；3.浙江大學動物科學學院，浙江 杭州 310029；4.桐廬縣質(zhì)量計量監(jiān)測中心，浙江 杭州 311500)

建立一種使用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS-MS)儀同時測定蜂王漿中的氟胺氰菊酯、三唑醇和蠅毒磷等藥物殘留量的方法。采用堿性條件下的乙腈萃取，并用HLB小柱凈化，經(jīng)HPLC-MS-MS電噴霧電離源，正離子多反應檢測模式檢測，外標法定量。結(jié)果表明：蠅毒磷的檢出限為2μg/kg，三唑醇和氟胺氰菊酯的檢出限為1μg/kg，在5～100μg/kg之間線性關系良好，相關系數(shù)均大于0.9940，對于5、10、50μg/kg水平添加回收率范圍在78.9%～102.1%之間，變異系數(shù)范圍在2.1%～13.6%之間。該分析方法適合蜂王漿中氟胺氰菊酯、三唑醇和蠅毒磷的同時測定，相對標準偏差和回收率測定結(jié)果符合對食品和農(nóng)產(chǎn)品中痕量藥物的測定要求。

蜂王漿；氟胺氰菊酯；蠅毒磷；三唑醇

農(nóng)藥的廣泛應用，在給人類帶來增產(chǎn)增收利益的同時也給環(huán)境造成了嚴重污染，大量食用含有三唑醇等農(nóng)藥殘留的食物會導致機體正常生理功能的失調(diào)，引起病理改變和毒性危害。因此，農(nóng)藥殘留的問題日益受到人們的關注，動物源性食品中的農(nóng)藥殘留檢測技術研究已經(jīng)成為解決貿(mào)易技術壁壘的關鍵所在。

氟胺氰菊酯、三唑醇和蠅毒磷等農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應用，是蜂王漿出口日本時有明確限量要求的3種農(nóng)藥殘留。關于農(nóng)藥殘留檢測方法已有許多報道，如氣相色譜法測定蠅毒磷和氟氰胺菊酯[1-2]，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測定食品中的三唑醇、氟氰胺菊酯[3-4]，高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測定蜂王漿中的氟氰胺菊酯[5-6]以及氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測蠅毒磷[7]等。多種農(nóng)藥殘留量同時測定方法可以提高檢測效率，降低檢測成本，是眾多檢測工作者的研究熱點[8-10]。蜂王漿基質(zhì)復雜，樣品凈化困難，目前對蜂王漿中多農(nóng)藥殘留同時測定的檢測技術研究較少[10-12]，迄今為止，同時測定蜂王漿中氟胺氰菊酯、三唑醇和蠅毒磷尚未見相關文獻報道。

本實驗采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測蜂王漿樣品中的氟胺氰菊酯、三唑醇、蠅毒磷3種農(nóng)藥殘留量，研究樣品的提取、凈化以及分析方法并用于實際樣品的檢測，以期建立準確、高效的蜂王漿中氟胺氰菊酯、三唑醇、蠅毒磷3種農(nóng)藥殘留的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

氟胺氰菊酯、三唑醇、蠅毒磷標準品(純度＞99%)德國Dr. Ehrenstorfer公司；無水硫酸鈉、氨水、正丙醇均為分析純；甲酸為優(yōu)級純；乙腈、甲醇、乙酸銨為色譜純；雙重蒸餾水。

API3200串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀 美國ABI公司； 1200高效液相色譜儀(配有二元泵、在線脫氣機、自動進樣器、Analyst數(shù)據(jù)處理軟件) 美國安捷倫科技公司；BS224S萬分之一分析天平 德國Sartorius公司；RJTDL-40B低速臺式大容量離心機 江蘇太倉儀器設備廠；RE-52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；HLB固相萃取小柱(200mg/6mL) 美國Waters Oasis公司。

1.2 方法

1.2.1 氟胺氰菊酯、三唑醇、蠅毒磷標準溶液的制備

按標準物質(zhì)證書標示含量進行計算，分別稱取標準品10mg，精確至0.0001g，于10mL容量瓶中用乙腈溶解分別定容至刻度，搖勻，則各標準品的儲備液質(zhì)量濃度為1000mg/L。

分別吸取氟胺氰菊酯、三唑醇、蠅毒磷標準儲備液，用乙腈稀釋成質(zhì)量濃度為10mg/L的混合標準中間液，0.2mL分裝，-18℃保存。

取混合標準中間液，用乙腈分別配制100μg/L和1000μg/L的混合標準使用液。

1.2.2 陰性樣品基質(zhì)混標標準曲線

分別稱取5份2.0g陰性蜂王漿樣品，用以制作陰性樣品基質(zhì)混標標準曲線，分別加100μg/L的混合標準使用液100、200、500，1000μg/L，旋渦混合3min，靜置15min，標準系列含量分別為5、10、25、50μg/kg和100μg/kg。

1.2.3 質(zhì)量控制

每天檢測陰性樣品回收率：2g王漿樣品中添加質(zhì)量濃度100μg/L的混合標準液200μL，以滿足添加質(zhì)量濃度為10μg/L的要求，回收率要求在70%～120%之間，添加標準液后應充分混合，然后靜置15min，再進行樣品處理。當試劑變動時對試劑進行干擾實驗。

1.2.4 樣品前處理

稱取(2±0.02)g試樣，精確至0.001g。置于50mL塑料離心管中，加入5mL水，分散均勻(干粉樣品需分散至成均勻的漿狀)，加入300μL氨水，分散均勻，加入10mL乙腈，充分振搖提取3～5min，加入8g無水硫酸鈉，充分振搖提取3～5min，6000r/min離心5min，吸取上清液于另一50mL離心管中，殘渣中加入5mL乙腈，用力振搖提取1～3min，6000r/min離心5min，合并上清液，加入5mL正丙醇，40℃減壓濃縮至干。加入10mL 50%乙腈超聲波溶解殘渣，用0.22μm膜過濾至10mL注射器，注射器與HLB固相萃取小柱連接。HLB固相萃取小柱先用5mL甲醇、5mL水活化，樣液以自然速度過柱，再用3mL水洗柱，真空抽干柱子15min。用10mL乙腈洗脫，收集洗脫液，40℃減壓濃縮至干，按體積比80:20加入1mL乙腈溶液溶解，溶解液用0.22μm膜過濾，待測。

1.2.5 色譜條件

經(jīng)過優(yōu)化的液相色譜條件：IntersiL ODS C8-3色譜柱(2.1mm×150mm，3μm)；進樣量20μL；流速：0.4mL/L；柱溫30℃；分析時間20min；梯度洗脫，洗脫液A為含0.1%甲酸的甲醇溶液，洗脫液B為含0.1%甲酸和0.5mmol/L乙酸銨的甲醇溶液，洗脫程序見表1。

表1 液相梯度洗脫程序表Table1 Gradient elution program for HPLC

1.2.6 質(zhì)譜條件

表2 3種藥物殘留的質(zhì)譜參考條件Table2 Mass spectral reference conditions for tau-fluvalinate, coumaphos and triadimenol residues

離子源：電噴霧電離(electrospray ionization，ESI)源，正離子；掃描方式：多反應監(jiān)測(multiple reactionmonitoring，MRM)；霧化氣、卷簾氣、輔助加熱氣、碰撞氣均為高純氮氣，離子源霧化溫度200℃；輔助加熱氣壓強60psi；干燥氣壓強50psi；氣簾氣壓強10psi；碰撞氣壓強5psi；電噴霧電壓4500.00V。其他電壓值、監(jiān)測離子對、定量離子對等具體條件見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理條件的確定

2.1.1 樣品提取條件的選擇

根據(jù)文獻[13-15]報道，選擇正己烷、丙酮、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、環(huán)己烷等有機溶劑在酸性條件下對農(nóng)藥進行提取，并使用固相萃取小柱進行凈化。發(fā)現(xiàn)樣品均有肉眼可見的淺黃色色素干擾，雜質(zhì)較多，基質(zhì)干擾大，并污染儀器和色譜柱。分析產(chǎn)生雜質(zhì)污染儀器和色譜柱的原因是酸性條件下用有機溶劑提取易引起色素、脂肪類等雜質(zhì)被大量提出，而在堿性條件下用正己烷、二氯甲烷、丙酮等溶劑進行提取，也容易有較多的色素被提出，因此后續(xù)凈化效果不佳。

乙腈作為AOAC法在有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯、氨基甲酸酯類等農(nóng)藥的分析中所采用的一種溶劑，對油脂和色素提取較少，是目前常用的一種提取溶劑。綜合蜂王漿的理化特性與文獻[16-20]報道情況，選擇堿性條件下乙腈提取農(nóng)藥殘留，使蜂王漿中的酸性物質(zhì)與堿反應成鹽，提高其極性而不被乙腈所提取，從而提高凈化效果。并且在乙腈中加入少量的正丙醇，調(diào)節(jié)乙腈的極性，增強凈化效果。通過比較氨水、氫氧化鈉兩種堿性溶劑的反應效果，發(fā)現(xiàn)用氨水的效果比較理想，濃縮時更容易干燥。提取后濃縮至干，用50%乙腈溶解時樣液呈無色，樣品的凈化程度大為改善。因此本實驗采用加入氨水的乙腈和正丙醇作為提取溶劑進行提取。

2.1.2 固相萃取小柱的選擇

為了提高檢測限，根據(jù)文獻方法及目標物質(zhì)的化學性質(zhì)，選擇了HLB固相萃取小柱和SupeLco C18固相萃取小柱，進行固相萃取凈化。結(jié)果3種農(nóng)藥殘留均在HLB固相萃取小柱被有效提取，在儀器上產(chǎn)生較大的響應，達到需要的檢測靈敏度。并且在凈化過程中，HLB固相萃取小柱不受樣液pH值的影響，具有更好穩(wěn)定性，因而選擇了HLB小柱作為凈化柱。

2.2 液相色譜條件優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

為保證不同性質(zhì)的多藥物殘留在色譜柱上的分離效率，選用HypersiL、AkasiL、VenusiL MP、Shim-pack VP、IntersiL等型號的色譜柱，以尋找分離度好、靈敏度高、峰形窄而對稱、定量離子無干擾的色譜柱。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HypersiL柱的氟胺氰菊酯色譜峰分叉，對稱性不好；AkasiL柱的氟胺氰菊酯和三唑醇的色譜峰對稱性均不好；VenusiL MP柱的3個峰分離度不夠；Shim-pack VP柱的對稱性和分離度雖然也可以達到要求，但和IntersiL C8-3相比，峰形不夠尖銳，分離度稍差。在所有色譜柱中，IntersiL C8-3色譜柱的靈敏度最好，峰形尖銳，分離度好，因此本實驗選擇IntersiL C8-3柱作為分析柱。

2.2.2 流動相及洗脫條件的選擇

為確保所測農(nóng)藥和雜質(zhì)能夠最大程度的分離，且分析周期短，不干擾農(nóng)藥和雜質(zhì)分離的檢測，分別對甲醇、乙腈作流動相的分離效果進行比較，并研究流動相中不同濃度的甲酸或乙酸對分離效果的影響，選擇合適的揮發(fā)性鹽類，提高離子化效率，以期獲得分離良好、峰形對稱、信號強度大、靈敏度高的色譜圖。結(jié)果表明，采用甲醇作為流動相中的有機相，加入0.1%甲酸和0.5mmol/L的乙酸銨作為流動相的信號最強，提高了靈敏度。本實驗優(yōu)選出的最佳色譜條件見表1。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

配制1μg/mL各種殘留標準溶液，用針泵以5μg/mL的流速進入質(zhì)譜儀，以正離子模式進行Q1 MS(Q1)全掃描，確定分子離子峰，調(diào)節(jié)離子源電壓、DP、EP參數(shù)，再以分子離子峰作為母離子，進行子離子掃描，調(diào)節(jié)CE參數(shù)，使母離子的強度占子離子強度的1/3～1/4為最佳，從質(zhì)譜圖中選擇2～4個信號較強的子離子作為定性離子，離子豐度最強的子離子為定量離子，采用針泵流動注射標準溶液，手動運行RAMP進行參數(shù)優(yōu)化。質(zhì)譜參數(shù)確定后，連接液相色譜進樣，由于各殘留的離子源溫度、輔助加熱氣、干燥氣、氣簾氣、電噴霧電壓等參數(shù)與在單純質(zhì)譜條件下發(fā)生變化，因此選擇適中的一組參數(shù)在液相條件下進行再優(yōu)化，進樣5μg/kg的混標在以50%乙腈溶液為流動相，在2.2.2節(jié)中的液相條件下，再進行優(yōu)化與微調(diào)，使各種物質(zhì)的靈敏度、峰形達到最佳。經(jīng)過多次調(diào)整得最佳質(zhì)譜條件見表2。

2.4 標準曲線方程、相關系數(shù)與最低檢出限

配制3種農(nóng)藥殘留的系列標準溶液，按照本方法優(yōu)化的色譜條件進樣測定。以y表示峰面積，x表示農(nóng)殘含量，得回歸方程和線性相關系數(shù)(表3)。以信噪比(RSN)為3對應的農(nóng)殘含量確定3種農(nóng)藥殘留的最低檢出限，蠅毒磷為2μg/kg，三唑醇和氟胺氰菊酯均為1μg/kg。蜂王漿中3種農(nóng)藥殘留測定的總離子流圖及提取離子流圖見圖1～4。

表3 3種藥物殘留的線性范圍和回歸方程Table3 Linear ranges and regression equations for tau-fluvalinate, coumaphos and triadimenol residues

圖1 陰性蜂王漿中添加氟胺氰菊酯、三唑醇和蠅毒磷的總離子圖Fig.1 Total ion chromatograms of blank royal jelly sample spiked with mixed standard solution of tau-fluvalinate, coumaphos and triadimenol

圖2 陰性蜂王漿中添加三唑醇的提取離子流圖Fig.2 Ion chromatogram of a single component in blank royal jelly sample spiked with triadimenol standard solution

圖3 陰性蜂王漿中添加氟胺氰菊酯提取離子流圖Fig.3 Ion chromatogram of a single component in blank royal jelly sample spiked with tau-fluvalinate standard solution

圖4 陰性蜂王漿中添加蠅毒磷的提取離子流圖Fig.4 Ion chromatogram of a single component in blank royal jelly sample spiked with coumaphos standard solution

2.5 方法的添加回收率與精密度

在蜂王漿陰性樣品中，分別對3個添加量的殘留標準品做6次平行，按本方法進行樣品的處理與測定，確定本方法的添加回收率和精密度。添加回收率和精密度結(jié)果見表4。添加回收率在78.9%～102.1%之間，變異系數(shù)小于15%，完全滿足國家規(guī)定的對痕量蠅毒磷、氟胺氰菊酯和三唑醇藥物殘留的同時測定需要。

表4 3種藥物殘留的添加回收率和變異系數(shù)Table4 Recovery rates and RSDs of tau-fluvalinate, coumaphos and triadimenol residues in fortified royal jelly

3 結(jié) 論

本實驗將高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法用于蜂王漿中蠅毒磷、氟胺氰菊酯和三唑醇藥物殘留的同時測定。利用一種樣品凈化方法，同時檢測3種農(nóng)藥殘留，提高了檢測效率，降低了檢測成本，并且該樣品凈化方法譜圖比較干凈，在分析復雜樣品且農(nóng)藥含量較低時有一定的優(yōu)勢。該方法的檢出限、回收率及精密度完全滿足對進出口貿(mào)易中蜂王漿殘留限量測定的需要。

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Simultaneous Determination of Tau-Fluvalinate, Triadimenol and Coumaphos Residues in Royal Jelly Using High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

ZHOU Ping1，LI Ying-hua2，HU Fu-liang3,*，ZHAO Huan1，WU Jie4，LIANG Shi-jun4
(1. Hangzhou Beewords Apiculture Group Co. Ltd., Tonglu 311500, China；2. Zhejiang Economic and Trade Polytechnic, Hangzhou 310018, China；3. College of Animal Science, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China；4. Measurement Center of Tonglu County, Hangzhou 311500, China)

A method for the determination and quantification of tau-fluvalinate, triadimenol and coumaphos in royal jelly was established by HPLC-MS-MS. Tau-fluvalinate, triadimenol and coumaphos residues were extracted by acetonitrile under alkaline condition, and clean-up of the extracts was carried out using HLB solid phase extraction (SPE) column. Quantif i cation was conducted by HPLC-MS-MS coupled with multiple reaction-monitoring (MRM) system using electron spray ionization source in an external standard mode. The detection limits for coumaphos, triadimenol and tau-fluvalinate residues were 2, 1 μg/kg and 1 μg/kg, respectively. The recovery rates of tau-f l uvalinate, triadimenol and coumaphos residues at three spiked levels (5, 10 μg/kg and 50 μg/kg) in different samples were in the range of 78.9%–102.1% with relative standard deviation of 2.1%–13.6%. The linear range of detection was 5–100 μg/kg (r ＞0.9940). This method can be successfully applied to the qualitative and quantitative analysis of royal jelly samples.

royal jelly；tau-f l uvalinate；triadimenol；coumaphos

O657.63；S896.8

A

1002-6630(2013)18-0180-05

10.7506/spkx1002-6630-201318036

2012-08-26

國家蜂產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項(CARS-45)；國家星火計劃項目(2010GA701004)

周萍(1968—)，男，工程師，本科，研究方向為蜂產(chǎn)品檢測。E-mail：tdbjhn@126.com

*通信作者：胡福良(1964—)，男，教授，博士，研究方向為蜜蜂科學。E-mail：flhu@zju.edu.cn