光電型傳感法快速檢測食品中大腸桿菌

葉雨丹，柴春彥*，劉國艷，王藝如

(上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院，上海 200240)

光電型傳感法快速檢測食品中大腸桿菌

葉雨丹，柴春彥*，劉國艷，王藝如

(上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院，上海 200240)

大腸桿菌可在異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的誘導下分泌β-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶特異性的催化氯酚紅-β-D-吡喃半乳糖苷(CPRG)生成氯酚紅(CPR)發(fā)生顯色反應(yīng)，而反應(yīng)顏色的深淺和大腸桿菌的濃度具有一定的對應(yīng)關(guān)系，從而建立檢測大腸桿菌的光電型傳感方法。結(jié)果表明：用光電傳感方法檢測大腸桿菌，最適反應(yīng)時間4h、最適反應(yīng)pH7.5。樣品中細菌濃度的對數(shù)與反射光信號值之間呈現(xiàn)良好的對應(yīng)關(guān)系(R=－0.98944，P＜0.01)，線性方程為Y=1426.10485－97.23368X，檢測限可達104CFU/mL。基于顏色反應(yīng)的光電傳感方法檢測大腸桿菌具有快速、簡便、成本低廉等優(yōu)點，具有良好的研發(fā)和應(yīng)用前景。

大腸桿菌；光電型傳感器；β-半乳糖苷酶；光電型試紙條

飲水和食品中大腸桿菌(E.coli)污染的監(jiān)測是目前食品衛(wèi)生安全控制過程中必檢的指標[1]。當前大腸桿菌的檢測技術(shù)有傳統(tǒng)的細菌檢測方法如細菌直接計數(shù)法、微生物培養(yǎng)法，檢測效果準確，但是檢測方法操作繁瑣、耗時長；生物學法如ATP生物發(fā)光法、免疫學方法、PCR技術(shù)等，特異性強、靈敏度高，但需要專業(yè)人員和專業(yè)設(shè)備，且無法滿足食品中常見大腸桿菌污染菌大批量快速檢測的需要[2-3]。對于食品中大腸桿菌的檢測，首先要滿足方法的可靠性和檢測的靈敏度，如果能夠快速檢測，同時價格低廉、操作簡便，則更加實用和易于普及推廣等[4-7]。近年來，國內(nèi)外在研究使用電化學生物傳感法檢測微生物方面取得了很大的進展，本實驗旨在探索一種快速檢測大腸桿菌的光電型生物傳感方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌 實驗室自行分離、鑒定；氯酚紅(CPR)、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG) 美國Sigma公司；肉湯培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂 上海伊華醫(yī)學科技有限公司；細菌凍存液 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Na2HPO4、NaH2PO4、HCl、NaOH等化學試劑均為分析純 中國醫(yī)藥集團上海試劑公司；實驗用水均為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

ELX800酶標儀 美國Bio-Tex公司；微型光電型生物傳感儀由本實驗室與上海交通大學電子與信息學院袁景淇教授實驗室合作開發(fā)；pHS-3C精密pH計 上海精密儀器儀表有限公司；玻璃纖維 上海統(tǒng)笙有限公司。

1.3 方法

1.3.1 光電型傳感方法檢測食品中大腸桿菌的實驗設(shè)計原理

大腸桿菌本身含有多種酶，在外界條件誘導下能分泌一些酶[8-9]。大腸桿菌在IPTG的誘導下可以分泌β-半乳糖苷酶，是較為典型的大腸桿菌誘導酶。β-半乳糖苷酶作用于氯酚紅-β-D-吡喃半乳糖苷(chlorophenol red-β-D-galactopyranoside，CPRG)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，使黃色的CPRG生成紅色的氯酚紅(chlorophenol red，CPR)，是明顯的顏色反應(yīng)[10-14]，該反應(yīng)顏色變化的深淺與大腸桿菌的濃度之間呈明顯的相關(guān)性。根據(jù)此反應(yīng)原理，參考相關(guān)文獻并結(jié)合本實驗的實際情況，使用本實驗室自行研制的光電檢測儀，測定不同濃度的大腸桿菌標準液對應(yīng)的光反射強度值的大小，繪制標準曲線，并優(yōu)化反應(yīng)條件，建立檢測大腸桿菌濃度的光電型生物傳感方法。

1.3.2 光電型傳感器的檢測

1.3.2.1 檢測大腸桿菌試紙條的組裝

試紙條組裝如圖1所示。

圖1 快速檢測大腸桿菌的試紙條設(shè)計圖Fig.1 The design of test strip for E. coli detection

1.3.2.2 檢測過程

精確稱取CPRG 0.01g，用pH7.5的PB緩沖液10mL將其溶解，將已被誘導產(chǎn)生半乳糖苷酶的大腸桿菌樣品滴入96孔酶標板中，加入配制好的CPRG溶液，反應(yīng)4h，將顯色后的混合液3滴滴在試紙條上，放入光電傳感器的檢測窗口，測定并記錄顯示數(shù)據(jù)。

1.3.3 大腸桿菌的篩選與培養(yǎng)

1.3.3.1 無菌培養(yǎng)基的制備

取營養(yǎng)肉湯22g、蒸餾水1000mL，于121℃溫度條件滅菌15min。

1.3.3.2 大腸桿菌的篩選與培養(yǎng)[15]

用無菌注射器吸取豆腐浸出液1mL接種到20mL無菌培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)12h，利用麥康凱培養(yǎng)基篩選，挑取粉紅色菌落，接種于20mL無菌培養(yǎng)基，37℃增菌培養(yǎng)。

1.3.4 大腸桿菌標準曲線的繪制

將大腸桿菌菌懸液用0.01mol/L B-R緩沖液(pH6)配成濃度梯度為104～109CFU/mL，然后進行半乳糖苷酶的誘導：首先取5mL營養(yǎng)肉湯制作的菌懸液，加入400μL濃度10mmol/L的IPTG溶液，37℃水浴培養(yǎng)45min誘導β-半乳糖苷酶，然后終止反應(yīng)10min。4000r/min離心10min，收集大腸桿菌，加入100μL PB制成懸浮液作為待測液[16-19]。將100μL待測液加入96孔酶板中，再加入等量CPRG溶液，混合均勻后于室溫條件下反應(yīng)。4h后出現(xiàn)顯色反應(yīng)，滴加兩滴待測液至試紙條上，將試紙條置于測試孔檢測后記錄光電傳感器顯示的吸光強度。根據(jù)不同濃度大腸桿菌標準液所對應(yīng)的不同光反射強度，建立標準曲線，用Origin 6.0求出回歸方程。

1.3.5 反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.3.5.1 最適反應(yīng)時間的確定

配制細菌群落數(shù)為105、106、107CFU/mL的大腸桿菌進行半乳糖苷酶的誘導，用光電型傳感器進行顯色反應(yīng)的檢測，每組做5個平行，結(jié)果取平均值。當光反射強度隨著時間發(fā)生變化時，反射強度達到最小時說明反應(yīng)進行充分，隨后反射光信號基本不變，以此確定反應(yīng)最適時間。

1.3.5.2 最適反應(yīng)pH值的確定

用酸堿緩沖液，即1mol/L的HCl-NaOH溶液將產(chǎn)生半乳糖苷酶的大腸桿菌誘導待測液的pH值分別調(diào)節(jié)為4、5、6、7、7.5、8、9、10，分別滴入檢測試紙條，用光電型傳感器進行顯色反應(yīng)的檢測，每個pH值做5個平行，結(jié)果取平均值。當光反射強度隨著pH值的變化而發(fā)生變化時，光反射強度達到最小時說明對應(yīng)的pH值為反應(yīng)最適pH值。

1.3.5.3 準確性的測定

使用光電型傳感器檢測已知含有大腸桿菌的50個陽性樣品與不含大腸桿菌的50個陰性樣品，按照公式(1)計算該方法的準確率。

1.3.5.4 回收率的測定

配制細菌群落數(shù)為105CFU/mL的大腸桿菌溶液，在光電型傳感器上進行檢測，平行10次，記錄光反射信號強度并計算用光電傳感法測得的大腸桿菌濃度，按照公式(2)計算該方法檢測大腸桿菌濃度的回收率。

1.3.6 光電傳感方法與傳統(tǒng)平板法檢測大腸桿菌效果的對比

平板劃線法是一種菌種的分離純化技術(shù)，可以把混雜在一起的微生物或同一微生物群體中的不同細胞用接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表面通過分區(qū)劃線稀釋而得到較多獨立分布的單個細胞，是一種傳統(tǒng)測定細菌個數(shù)的方法。選取市場上銷售的豆腐樣品，取其浸出液，121℃滅菌15min，吸取人為稀釋的102CFU/mL大腸桿菌菌懸液接種至滅菌的豆腐浸出液中進行增菌培養(yǎng)，做5個平行樣本，每隔0.5h進行檢測，并對平板劃線法和光電型生物傳感器法的檢測效果進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 光電試紙條的制備

圖2 光電型試紙條實物圖Fig.2 The photoelectric test strip

由于大腸桿菌含量越高，誘導出的β-半乳糖苷酶越多，催化反應(yīng)越完全，產(chǎn)生紅色的CPR越多。隨著樣品中大腸桿菌濃度的不斷增減，顏色由黃色到紫紅色變化(圖2表示淺灰色至深黑色)。

2.2 最適反應(yīng)時間的確定

圖3 反應(yīng)時間對光反射強度的影響Fig.3 The curve of strip light reflection intensity versus time after color reaction of different concentrations of E. coli

由圖3可知，當光反射強度達到最低點時反應(yīng)充分，隨后曲線趨于平穩(wěn)。同時可以看出向試紙條滴加不同濃度的大腸桿菌溶液后，顯色反應(yīng)的速度隨著大腸桿菌濃度的增加有所加快。在反應(yīng)4h之后，反應(yīng)基本完成，因此選取4h為最佳反應(yīng)時間。

2.3 最適反應(yīng)pH值的確定

圖4 反應(yīng)pH值對光反射強度的影響Fig.4 The curve of strip light reflection intensity versus time after color reaction at different pH levels

由圖4可以看出，當用pH7.5的緩沖液配制大腸桿菌溶液時，所得到的光反射率最小，說明在此pH值條件下反應(yīng)最為充分，當反應(yīng)pH值偏小或偏大時，都會對酶的催化活性產(chǎn)生影響。β-半乳糖苷酶在pH7.5，即在中性略堿性條件有最強催化能力，可以得到較理想的顯色效果，因此選取pH7.5為最適反應(yīng)pH值。

2.4 光電型傳感器檢測大腸桿菌的標準曲線

隨著大腸桿菌濃度的增加，顯色試紙條的反射率逐漸降低。而且光反射率與相應(yīng)細菌濃度的對數(shù)呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=1426.10485－97.23368X，R=－0.98944(P＜0.01)，檢測限為104CFU/mL。

2.5 準確率及回收率的檢測結(jié)果

用本實驗建立的檢測大腸桿菌的光電型傳感方法檢測50個陽性樣品和50個陰性樣品，結(jié)果有46個陽性樣品檢測結(jié)果為陽性，50個陰性樣品檢測為陰性，其準確率達到了96%。當大腸桿菌濃度較低時，也可通過增菌的方式來提高檢測的準確性，大約增菌3h即可達到檢測標準。另外，用光電型傳感器檢測已知濃度的大腸桿菌標準樣品，經(jīng)統(tǒng)計其回收率為91.4%。

2.6 光電傳感方法與傳統(tǒng)平板法檢測大腸桿菌效果的對比

表1 生物傳感法與平板計數(shù)法對人為增菌處理的豆腐樣品的檢測結(jié)果對比Table1 Comparison of the results obtained by biosensor method and plate count method for artificially enriched

從表1可以看出，在增菌3h后，可以根據(jù)樣品在傳感器檢測時反射光強度與標準曲線相應(yīng)的強度對應(yīng)的細菌含量值對比，從而較為準確地檢測到大腸桿菌含量。并且利用生物傳感法與平板計數(shù)法無顯著性差異(P＞0.05)，但是時間卻大大短于平板計數(shù)法所需的48h[20-21]。因此，與傳統(tǒng)的平板法相比，光電傳感法具有更快速、簡便，檢測費用更低等優(yōu)點。

3 結(jié) 論

本實驗探索了一種檢測大腸桿菌的新方法，即使用光電型傳感器對大腸桿菌進行檢測。該法的最適反應(yīng)時間4h、最適反應(yīng)pH7.5，準確率和回收率都達到了90%以上。當大腸桿菌濃度較低時，可通過增菌的方式來提高檢測的準確性，大約增菌3h 即可達到檢測標準，優(yōu)于傳統(tǒng)劃平板的48h 。樣品中細菌濃度的對數(shù)與光反射強度之間呈現(xiàn)良好的對應(yīng)關(guān)系(R=－0.98944，P＜0.01)，線性方程為Y=1426.10485－97.23368X，檢測限可達104CFU/mL。該方法簡便易行，為大腸桿菌的檢測提供了一種新途徑。

[1] 陳炳卿, 孫長頗. 食品污染與健康[M]. 北京: 化學工業(yè)出版社, 2002: 34-37.

[2] 馬冬, 宋宏新, 李明亮, 等. PCR檢測乳品中大腸桿菌的研究[J]. 食品科學, 2009, 30(4): 260-263.

[3] 巢強國, 楊學明, 葛宇, 等. PCR檢測牛乳中大腸桿菌O157:H7[J]. 食品科學, 2010, 31(8): 212-215.

[4] 程欲曉, 金利通. 電化學/生物傳感器快速檢測大腸桿菌的研究進展[J]. 化學傳感器, 2009, 29(1): 3-8.

[5] PARK C H, VANDEL N M, HIXON D L. Rapid immunoassay for detection of Eseheriehia coli O157 directly from stool specimens[J]. Journal of Clinical Microbiology, 1996, 34(4): 988-990.

[6] 李杜娟, 王劍平, 應(yīng)義斌, 等. 檢測食源性致病菌的生物傳感器[J].中國生物化學與分子生物學報, 2007, 23(3): 194-199.

[7] 劉素芹, 戴高鵬, 王啟會. 快速檢測牛奶中大腸桿菌的壓電生物傳感器研究[J]. 食品科學, 2009, 30(4): 207-209.

[8] 崔建東, 張云峰, 李艷. 苯丙氨酸解酶重組大腸桿菌產(chǎn)酶條件研究[J].食品科學, 2009, 30(7): 181-185.

[9] 龐敏, 李朝生, 馮瑞彩, 等. 大腸桿菌色氨酸酶的制備及酶學性質(zhì)[J].食品科學, 2011, 32(1): 189-192.

[10] SU Xiaoli, LI Yanbin. A self-assembled monolayer-based piezoelectric immunosensor for rapid detection of Escherichia coli O157:H7[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2004, 19(6): 563-574.

[11] HAN Shubo, LI Xi, GUO Guangmei, et al. Voltammetric measurement of microorganism populations[J]. Analytica Chimica Acta, 2000, 405(1/2): 115-121.

[12] BANG G S, KIM B G. A novel electrochemical detection method for aspartamebBiosensors[J]. Bioelectron, 2005, 21(6): 863-870.

[13] WUTOR V C, TOGO C A, LIMSON J L, et al. A novel biosensor for the detection and monitoring of β-D-galactosidase of fecal origin in water[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2007, 40(6): 1512-1517.

[14] LOAIZA O A, COMPUZANO S, PEDRERO M J, et al. DNA sensor based on an Escherichia coli gene probe immobilization at selfassembled monoalayers-modified gold electrodes[J]. Talanta, 2007, 73(5): 838-844.

[15] 賴衛(wèi)華, 馮貽澤, 白熙安·克羅澤道森. 大腸桿菌O157:H7快速培養(yǎng)的初步研究[J]. 食品科學, 2009, 30(7): 145-147.

[16] 商璟, 柴春彥, 張洪才, 等. 快速檢測痕量鎘的光電型傳感器的建立[J].食品科學, 2011, 32(18): 82-285.

[17] 劉海峰, 柴春彥, 劉國艷. 光電型傳感器在快速檢測食品中過氧化氫中的應(yīng)用[J]. 食品科技, 2008(11): 278-282.

[18] 商璟, 柴春彥, 張洪才, 等. 痕量銅光電型傳感器檢測方法建立[J].中國公共衛(wèi)生, 2011, 27(11): 1498-1499.

[19] 商璟, 翁芝瑩, 柴春彥, 等. 快速檢測痕量汞的光電型傳感方法的建立[J]. 上海交通大學學報: 農(nóng)業(yè)科學版, 2012, 29(2): 56-59.

[20] GB/T 4789.2—2008 食品衛(wèi)生微生物學檢測: 菌落總數(shù)測定[S].

[21] LEE Y G, WU H Y, HSU C L, et al. A rapid and selective method for monitoring the growth of coli forms in milk using the combination of amperometric sensor and reducing of ethylene blue[J]. Sensor Actuators, 2009, 141(2): 575-580.

Development of Photoelectric Sensor for Detection of E. coli

YE Yu-dan，CHAI Chun-yan*，LIU Guo-yan，WANG Yi-ru
(School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)

E. coli secretes β-galactosidase under the induction of isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). The β-galacosidase catalyzes chlorophenol ReD-β-D-galactopyranoside (CPRG) to form chlorophenol red (CPR) along with a color reaction. Based on the significant correlation between intensity of the color change from the reaction and the concentration of E. coli, a photoelectric sensor for detecting E. coli was developed. The results showed that the optimal pH for the reaction system was 7.5 and the optimal time for enzymatic reaction was 4 h. The logarithm value of bacterial concentration in samples presented a significant correlation with the reflected light signal value (R = －0.98944, P ＜ 0.01), the linear equation was Y = 1426.10485 － 97.23368X. The detection limit was 104CFU/mL. The photoelectric sensor based on color reaction can provide a quick, simple and cheap way to detect E. coli in food samples and therefore deserves further development and application.

E.coli；photoelectronic sensor；β-galactosidase；photoelectric test strip

O657.1

A

1002-6630(2013)18-0185-04

10.7506/spkx1002-6630-201318037

2012-07-28

國家科學技術(shù)部和上海市科委共同資助的“世博專項”項目(06dz05825)；上海獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室項目(0890259)

葉雨丹(1988—)，女，碩士研究生，研究方向為食品安全檢測與控制。E-mail：yoyoleaf@sina.com

*通信作者：柴春彥(1969—)，男，教授，博士，研究方向為食品安全檢測與控制。E-mail：cychai88@sjtu.edu.cn