SA-UPLC-MS-MS聯用測定奶粉中雙氰胺的殘留量

張憲臣，王 勇，張朋杰，華洪波，李云松,*，李 蓉，李浩洋，楊 芳，盧俊文，謝思思

(1.中山出入境檢驗檢疫局，廣東 中山 528403；2.中山市外語外貿大學附設外語學校，廣東 中山 528401)

SA-UPLC-MS-MS聯用測定奶粉中雙氰胺的殘留量

張憲臣1，王 勇1，張朋杰1，華洪波2，李云松1,*，李 蓉1，李浩洋1，楊 芳1，盧俊文1，謝思思1

(1.中山出入境檢驗檢疫局，廣東 中山 528403；2.中山市外語外貿大學附設外語學校，廣東 中山 528401)

建立超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS-MS)檢測奶粉中雙氰胺殘留量的檢測方法。以氘代試劑為內標，樣品經氨化乙腈萃取后，平行定量濃縮儀濃縮，用正己烷脫脂，采用UPLC-MS-MS選擇反應監測(SRM)正離子模式測定。雙氰胺的檢出限可達10?g/kg，最低定量限可達50?g/kg。在10～1000ng/mL范圍內峰強度與質量濃度的線性關系良好(r＞0.990)。方法的平均回收率在99.6%～102.3%之間。方法簡單、快速、穩定、準確、靈敏度高，能夠滿足日常工作中奶粉雙氰胺的檢測要求。

超高效液相色譜-串聯質譜；平行定量濃縮儀；雙氰胺；奶粉

雙氰胺(二氰二氨，縮寫DCD)，是氰胺的二聚體，因其氰基官能團能與硝化菌的巰基官能團結合而具有較好的硝化抑制效果。雙氰胺可用作制取雙氰胺化肥，雙氰胺復合肥料可控制硝化菌的活動，使氮肥在土壤中的轉化速度得到調節，提高肥料的使用效率[1-5]。雙氰胺與酸反應，可制造各種胍鹽[6-9]。雙氰胺和苯基腈反應得到的苯代三聚氰二胺是涂料，層壓板、成型粉的中間體，雙氰胺還作為練漂劑用于紡織工業[10]。人吸入、攝入或經皮膚吸收后對身體有害。2013年1月，享譽全球的新西蘭牛奶及奶制品被檢測出含有低含量的有毒物質雙氰胺，新西蘭政府已經下令禁售含有雙氰胺的奶類產品。該事件把雙氰胺污染物推到了風口浪尖，現今國際標準未對奶粉中的雙氰胺限量，國內也無對奶粉中雙氰胺相關的檢測標準和限量。由于雙氰胺極性較強，很難吸附到普通的固相萃取柱，有機溶劑提取時極易發生蛋白沉淀，影響雙氰胺的回收，因此奶粉中雙氰胺的測定一直是檢測機構研究的難點。

當前有關雙氰胺的檢測方法主要有陽離子交換法[11]、比色法、選擇電極法、酶促法、pH值法、高效液相色譜法[12-16]、液質聯用法[17-21]等。本實驗采用平行定量濃縮儀-超高效液相色譜-串聯質譜(syncore analyst-ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，SA-UPLC-MSMS)技術，依據其高靈敏度和選擇性，建立了測定奶粉中雙氰胺的方法。配方奶粉基質復雜，通常添加乳清蛋白、DHA、微量元素、維生素和某些氨基酸等成分，且雙氰胺極性較強，因此使用普通的前處理方法被測組分損失較大，回收率低，難以達到正常的檢測要求。本實驗采用溫水溶解奶粉，能夠有效的克服蛋白沉降的問題；氨化乙腈提取，能夠有效地提高被測組分的提取效率；冷凍離心除雜，能夠有效地減少雜質的干擾；平行定量濃縮儀濃縮，能夠有效地提高濃縮效率，方法簡單、快速、準確、穩定、靈敏度高，適合于食品實驗室大批量檢測奶粉中雙氰胺的殘留量。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

進口奶粉樣品(新西蘭2012年12月產惠氏奶粉)由中山出入境檢驗檢疫局食檢科提供。

標準品：雙氰胺(純度大于99%) 天津Agela Technologies公司；雙氰胺內標(純度99.3%) 加拿大TRC公司；甲醇、乙腈、正己烷(色譜純) 美國Fisher公司；甲酸(色譜純) 上海晶純實業有限公司；醋酸銨(色譜純) 德國Merck公司；氨水(含量為25%～28%，優級純) 廣州化學試劑廠；無水硫酸鈉(分析純)。實驗用水為Milli-Q水(蒸餾水經Millipore, Bedford, MA, USA產純水機處理后的超純水)。

TSQ Quantum超高效液相色譜與串聯質譜聯用儀(ESI源)、lcqun液相色譜-質譜工作站軟件 美國Thermo Fisher Scientific公司；平行定量濃縮儀、B-740再循環冷卻系統、V-700/701真空泵 瑞士Büchi公司；超聲波清洗器 南京皓海科學儀器儀表有限公司；高速冷凍離心機 美國Beckman公司；0.25?m水相濾膜 上海安普科技儀器有限公司；天平(感量0.1mg和0.001g)。

1.2 對照品溶液的配制

準確稱取雙氰胺對照品10mg(精確至0.01mg)，置于100mL容量瓶中，用體積分數50%乙腈溶液溶解，定容，搖勻，作為對照品儲備液。

準確稱取雙氰胺內標對照品5mg(精確至0.01mg)，置于50mL容量瓶中，用體積分數50%乙腈溶液溶解，定容，搖勻，作為對照品儲備液。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agela Technologies Venusil HILIc柱(150mm×2.1mm，5?m)；柱溫：室溫；進樣量：10?L；流動相：A為0.2mmol/L醋酸銨(用甲酸調pH值至4.0)，B為乙腈；梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1ble 1 Mobile phase compositon for gradient eluction

1.3.2 質譜條件

離子化模式：電噴霧離子(electrospray ionization，ESI)源，正離子模式；噴霧電壓：4500V；鞘氣流量：28L/min；輔助氣流量：5L/min；離子傳輸管溫度：350℃；掃描模式、定量和定性離子對、碰撞能量參數見表2。

表2 測定雙氰胺和雙氰胺內標的串聯質譜參數Table2 MS-MS parameters for the determination of dicyandiamide and dicyandiamide-15N4

1.3.3 樣品預處理

稱取試樣1.0g(精確到0.01g)于20mL帶塞離心管中，加入40μL的內標標準工作液(5μg/mL)，渦旋混合30s，加入3.0mL 60℃溫水渦旋1min，再加入7.0mL氨化乙腈渦旋1min，超聲5min。以15000r/min(－10℃)冷凍離心15min。吸取上清液，用平行定量濃縮儀濃縮至干，以1.0mL起始流動相復溶，加入3mL正己烷渦旋混合1min，棄去上清液，再加入3mL正己烷渦旋混合1min，吸取下層溶液1.5mL置2mL離心管中，以14000r/min離心5min，棄上層液，取下層清液，經0.22μm有機相針式濾膜，供液相色譜-串聯質譜儀測定。

2 結果與分析

2.1 前處理方法的優化

本研究最初選擇固相萃取法對樣品中的雙氰胺進行提取凈化，由于雙氰胺極性較強，很難吸附到固相萃取小柱上，本實驗使用Hypercarb、PCX(用于三聚氰胺前處理)、Pesticarb等SPE小柱進行凈化，效果均不理想。

參考GB/T 22388—2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》中的前處理方法，最初選擇使用三氟乙酸-水溶液(1:99，V/V)溶解奶粉，結果發現處理完樣品溶液上機檢測后，雙氰胺的定量離子m/z 43.5被屏蔽掉，質譜無法檢測到該碎片離子。本研究又選擇常溫條件下蒸餾水溶解奶粉，加入氨化乙腈后奶粉中蛋白迅速沉降，雙氰胺回收率低于50%。把常溫蒸餾水逐步升溫至60℃溫水溶解奶粉，緩慢加入氨化乙腈，樣品中雙氰胺回收率能夠達到90%以上(圖1)，誤差范圍為±5%。冷凍離心的時間也對樣品中回收率有顯著影響，離心時間越長，溫度越低，檢測圖譜中雜質峰越少，雙氰胺的回收率越高。在空白樣品中進行加標回收實驗，樣品中加入50?g/kg的雙氰胺標準品(圖2)，結果顯示在－10℃條件下，15000r/min高速離心15min，雙氰胺色譜峰能夠達到基線完全分離，回收率可達到90%以上。

圖1 水溫對奶粉中雙氰胺的回收率的影響Fig.1 Effect of water temperature on the recovery of dicyandiamide

研究發現提取溶液對雙氰胺的回收率有較大影響，2%氨化乙腈的提取效果明顯好于甲酸-乙腈(1:99，V/V)和乙腈的提取效果。由于氨化乙腈提取液沸點較高，用氮吹濃縮或旋轉蒸發濃縮時間都比較長，且長時間高溫會破壞氨化乙腈中雙氰胺的穩定性，影響其回收率。本實驗采用選擇Buchi Syncore平行定量濃縮儀進行樣品提取液的濃縮，并對濃縮的條件進行考察，確定濃縮溫度為37℃；冷凝溫度為0℃；真空度40mbar濃縮至干，該方法僅需1h就可以完全蒸干24份樣品提取液。蒸干殘渣加入樣品定容溶液后采用正己烷脫脂和高速離心2次脫脂，得到澄清透明的樣品溶液，完全滿足質譜的凈化要求。該處理方法樣品的回收率均大于90%，并且能夠同時批量處理樣品，能夠有效的降低檢測成本，提高檢測效率。

圖2 不同溫度和離心時間的雙氰胺色譜圖Fig.2 Chromatograms of dicyandiamide with high speed centrifugation for different time under different temperatures

2.2 色譜與質譜條件的確立

2.2.1 色譜條件優化

采用反相高效液相色譜法對樣品中雙氰胺進行分析，由于雙氰胺極性較強，常規C18色譜柱對其保留很弱。雙氰胺分子結構中帶有氨基，本研究選擇HILIC親水柱對其進行色譜分離，分離效果非常理想。考慮到電噴霧電離模式為正離子模式(ESI+)，故在流動相中加入甲酸加強質子化效果。使用水和乙腈為流動相對雙氰胺標準溶液進行分離，結果發現標準溶液響應重復性很差、峰展寬且拖尾嚴重。這是由于目標化合物質子化程度受流動相pH值影響嚴重而造成的，因此在流動相中引入緩沖鹽，保持其相對穩定的酸度。考慮到HILIC柱對pH值的要求，最終選擇pH4.0的0.2mmol/L乙酸銨緩沖鹽和乙腈作為流動相。

2.2.2 質譜條件優化

在電噴霧正離子方式下對雙氰胺和雙氰胺內標進行一級質譜分析(Q1掃描)，得到分子離子，即母離子。對獲得的離子峰進行二級質譜掃描，得到碎片信息，即子離子(圖3)；優化碰撞能量和錐孔電壓，確定最佳的質譜條件。由于雙氰胺定量離子m/z 43.5在質譜掃描范圍m/z (50～1500)最低限附近，因此方法優化前應對質譜進行調諧校正。

圖3 雙氰胺的二級質譜圖Fig.3 MS-MS spectrum of dicyandiamide

2.3 方法的線性關系及靈敏度

準確量取適量的混合標準品儲備工作液和同位素內標儲備工作液，用乙腈-水(85:15，V/V)溶液稀釋成質量濃度分別為10、50、100、200、500、1000?g/L的標準品工作液。以雙氰胺質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，結果顯示雙氰胺的質量濃度在10～1000?g/L范圍內線性關系良好，相關系數r＞0.9900，見表3。

檢出限(LOD)和定量限(LOQ)采用向空白樣品中逐級降低加標濃度的方法來確定。以3倍信噪比(RSN=3)對應的目標物含量為檢出限，以RSN=10對應的目標物含量為定量限，獲得奶粉中雙氰胺的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)結果見表3。

表3 雙氰胺的線性關系、檢出限和定量限Table3 Linear relationship, LOD and LOQ for dicyandiamide

2.4 方法的準確度和精密度

在試樣中進行3水平的添加回收實驗，每個濃度平行作6個重復實驗。在空白試樣中雙氰胺的回收率均在99.6%～102.3%之間，相對標準偏差(RSD)均在2.9%～8.2%之間(表4)。該方法的回收率和RSD均符合殘留分析要求。

表4 樣品加標回收率和相對標準偏差Table4 Recoveries and RSD for dicyandiamide in spiked sample

2.5 實際樣品的檢測

利用本研究建立的分析方法對新西蘭進口30批不同品牌的奶粉進行檢測，其中8批樣品檢出雙氰胺。

3 結 論

采用氨化乙腈溶液提取，平行定量濃縮儀濃縮，用HILIC色譜柱進行色譜分離，建立了奶粉中雙氰胺快速檢測方法。方法檢出限可達10?g/kg，定量低限可達50?g/kg，方法簡單、快速、準確、重復性好、靈敏度高，適合于奶粉中雙氰胺的檢測。

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Determination of Dicyandiamide Residues in Milk by Syncore Analyst-Ultra Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Xian-chen1，WANG Yong1，ZHANG Peng-jie1， HUA Hong-bo2，LI Yun-song1,*，LI Rong1，LI Hao-yang1，YANG Fang1，LU Jun-wen1，XIE Si-si1
(1. Zhongshan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhongshan 528403, China；2. Zhongshan Foreign Language School Attached to Guangdong University of Foreign Studies, Zhongshan 528401, China)

A method for the determination of dicyandiamide in milk was developed by syncore analyst/ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (SA-UPLC-MS-MS). Deuterium substituted reagents were used as internal standards and added to the sample before extraction. The mixture was extracted with aminated acetonitrile, concentrated with syncore analyst, and cleaned up by hexane. The mass spectrometer was operated in the positive ion mode using select reaction monitoring for qualitative and quantitative analysis of dicyandiamide. The limit of detection (LOD) for dicyandiamide were 10 ?g/kg, and limit of quantitation (LOQ) were 50 ?g/kg. The correlation coefficient of the linear calibration curve was over 0.990 within the dicyandiamide concentration range 10–1000 ng/mL. The average recoveries for dicyandiamide were 99.6% to 102.3% (n = 6). The proposed method is simple, rapid, reliable, stable and sensitive. It can meet the requirements for the determination of dicyandiamide in milk.

ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (UPLC-MS-MS)；syncore analyst (SA)；dicyandiamide；milk

O658

A

1002-6630(2013)18-0231-04

10.7506/spkx1002-6630-201318047

2013-04-22

廣東省自然科學基金項目(7301741)；中山市科技計劃項目(20103A235；20123A272)；廣東檢驗檢疫局科技計劃項目(2012GDK49)

張憲臣(1976—)，男，工程師，碩士，研究方向為食品中有害物質分析。E-mail：zhangxc@zs.gdciq.gov.cn

*通信作者：李云松(1976—)，男，工程師，碩士，研究方向為化學分析。E-mail：liys@zs.gdciq.gov.cn