HLA-DRB1基因多態性與糖尿病并發肺結核易感性的研究①

王育華，王玉潯，安雅臣，紀春梅，劉國榮，趙曉晶，高素玲，張江，王艷，馮福民

HLA-DRB1基因多態性與糖尿病并發肺結核易感性的研究①

王育華1，王玉潯2，安雅臣2，紀春梅3，劉國榮2，趙曉晶2，高素玲2，張江2，王艷2，馮福民2

目的探討HLA-DRB1基因多態性與我國北方漢族糖尿病并發肺結核易感性的關系。方法采用1∶1配對的病例對照研究設計，以我國北方漢族124例糖尿病并發肺結核患者為研究對象，以與病例同民族、同性別、年齡相差不超過3歲，相同居住地(城市或農村)，且經統一結核菌素試驗(PPD)確認為有結核分支桿菌感染的2型糖尿病患者為對照組；采用聚合酶鏈反應-特異性序列引物(PCR-SSP)的方法檢測HLA-DRB1基因DR15、DR16、DR1、DR11位點多態性，對與肺結核相關的危險因素進行問卷調查，應用SPSS軟件進行單因素和多因素條件Logistic回歸分析。結果在病例組中，攜帶DR15基因突變型患肺結核的風險增高(OR＝2.461,95%CI:1.363～4.444,P=0.002)；DR15位點突變與DR16位點突變同時存在時風險更大(OR=4.904,95%CI:1.554～15.476)。對17個環境危險因素進行單因素分析，在多因素分析中調整卡痕、體質量指數、家族史3個因素后，DR15突變基因型仍與糖尿病并發肺結核顯著相關(OR=2.996,95%CI:1.51～5.945)。結論HLA-DR15基因突變型可能為2型糖尿病并發肺結核的易感基因型。

結核；肺；糖尿病；HLA基因；基因多態性；病例對照研究

1 對象與方法

1.1 對象

1.1.1 病例組 2010年3月～2012年6月在唐山市結核病醫院連續確診的2型糖尿病并發初治繼發型肺結核患者，糖尿病和肺結核的診斷明確，糖尿病病程在1年以上，且確診時間早于肺結核1年以上，并排除肺炎、肺癌、塵肺、長期使用腎上腺皮質激素及其他免疫抑制劑、HIV感染等免疫功能低下可能影響易感性的患者。

1.1.2 對照組 對照組來自河北聯合大學附屬醫院同期住院的2型糖尿病患者，且要求與病例同民族、同性別、年齡相差不超過3歲，相同居住地(城市或農村)，且經統一結核菌素試驗(PPD)確認為有結核分支桿菌感染的2型糖尿病患者(有卡痕者PPD硬結反應平均直徑≥10 mm[4-5]，無卡痕、無卡介苗接種史者PPD硬結反應平均直徑5～10 mm)，且排除：①與研究對象有血緣關系；②現在或既往有結核病史。本研究采用1∶1匹配的方法，嚴格按照對照組納入排除標準選擇2型糖尿病患者為對照組，且保證與每例病例匹配的對照至少有2例，在其中隨機選取1例與病例結為對子。另外咳嗽2周以上或經胸部X線檢查有可疑肺結核病變者也予以排除。

1.2 方法

1.2.1 問卷調查 設計統一的專用調查表，經過預調查及反復修訂后正式應用。采用面對面問卷調查形式，由經過統一培訓的調查人員逐一詢問調查表內容并認真填寫，內容包括研究對象出生年月、職業、文化程度、民族、婚姻狀況、呼吸系統疾病史及其他重大疾病史、煙酒嗜好、衛生習慣、飲食生活習慣、家庭經濟狀況、住房狀況、家族患結核病情況、結核病接觸史、卡介苗接種史及其他系統疾病史和服藥史。

1.2.2 PPD試驗篩選 所有入選人員均采用孟都氏(Mantous)法[4]行PPD實驗檢查。

1.2.3 基因組DNA的獲取 每個研究對象晨起空腹抽取靜脈血5 ml，2%EDTA 0.5 ml抗凝，冰盒保存。采用低滲溶血法分離白細胞，常規酚/氯仿抽提法提取基因組DNA。

1.2.4 聚合酶鏈反應(PCR)擴增目的DNA片段 引物設計參照參考文獻[5]，反復核實堿基序列，委托大連寶生物公司合成引物，同時合成NRAMP1-Exon8作為陽性內參照物，如表1。PCR擴增體系：25 μl體系，其中1U Taq DNA聚合酶，2.5 μl 10×PCR Buffer，5.0 μl dNTPs，上下游引物各1.0 μl，DNA模板1.0 μl，滅菌雙蒸水14.5 μl。循環體系：94℃預變性60 s，94℃變性60 s，60℃復性30 s，72℃延伸30 s，5個循環；94℃變性15 s，60℃復性25 s，72℃延伸20 s，終末延伸72℃300 s，28個循環。以DR15位點為例，擴增產物于1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，以DL-2000為標準分子量，樣品在紫外燈下觀察(234 bp為內參)。

1.3 統計學分析

采用EXCEL 2003建立數據庫，SPSS 12.0進行統計分析，顯著性水平α=0.05。采用條件Logistic回歸模型進行單因素分析和多因素逐步回歸分析。計算各因素的比值比(OR)及其95%可信區間(CI)，來估計相對危險度(RR)。顯著性檢驗采用最大似然比檢驗方法。

2 結果

2.1 一般情況

在連續收治的124例漢族成人糖尿病并發肺結核住院患者中，男性83例(66.9%)，女性41例(33.1%)，兩者比例約為2∶1；來源于農村的患者75例(60.5%)，來源于城市的患者49例(39.5%)，兩者比例約為3∶2。男性患者平均年齡(47.0±15.8)歲，女性平均年齡(37.4±14.7)歲。按照對照組配對條件最后隨機抽出124例糖尿病患者作為對照組，其中男性平均年齡(44.9±15.2)歲，女性(42.3±12.1)歲，經配對t檢驗(t＝0.843和1.671，P＞0.05)與病例組年齡無顯著性差異。

2.2 有關因素的條件Logistic回歸分析

研究因素的賦值方式見表1。

2.2.1 單因素分析 經單因素條件Logistic回歸分析發現，與糖尿病并發肺結核發病有聯系的因素有：體質量指數(BMI)、卡介苗接種史、卡痕、結核病接觸史和結核病家族史。BMI≤20、無卡介苗接種史、無卡痕、接觸史、結核病家族史等因素會增加肺結核發病的危險性；而BMI高則能減少肺結核發病的危險性。DR15基因型肺結核發病的風險亦增高，故DR15基因突變型可能是糖尿病并發肺結核發病易感基因型。見表2。

2.2.2 多因素分析 為排除各研究因素之間的相互干擾作用，控制混雜因素的影響，我們將單因素分析中有顯著意義的變量作為協變量，同時分別引入研究對象的基因型，以糖尿病患者肺結核是否發病為因變量，進行多因素條件Logistic回歸分析，結果顯示調整卡痕、家族史、BMI后，DR15突變基因型仍與肺結核發病顯著相關(OR=2.996,95%CI:1.51～5.945)。見表3。

2.2.3 基因位點聯合作用分析 為分析各基因位點多態性之間的聯合作用，對各基因型多態性位點進行叉生分析。結果發現，在DR15位點突變的情況下，如果存在DR16位點突變，則肺結核發病風險更大。見表4。

表1 Logistic回歸模型中各因素的賦值方式

表2 單因素條件Logistic回歸分析

表3 肺結核病發病影響因素的多因素條件Logistic回歸分析

表4 HLA-DRB1基因多態位點在兩組中的聯合分析

3 討論

當前普遍認為，糖尿病患者體內胰島素分泌不足，導致糖、蛋白質、脂肪代謝紊亂，造成營養不良，有利于結核桿菌的入侵和發展；同時因為糖尿病患者血內糖量增多，脂肪代謝異常，甘油產物蓄積，代謝性酸性環境均有助于結核桿菌的生長生殖[6]，致使并發結核病的機率增加。糖尿病由于糖代謝紊亂，導致糖原異生作用加強，蛋白分解加速以致抗體補體和免疫球蛋白生成減少，致使機體抗體水平減低和免疫力下降，降低機體防御功能。另外，糖尿病患者維生素A缺乏，使呼吸道黏膜上皮對外界感染抵抗力下降，易被結核桿菌感染。

大量遺傳學證據表明，肺結核的發生是環境因素與機體遺傳因素共同作用的復雜結果。現代結核病的研究和進展已經證明，個體對結核病易感性的差異部分是由宿主基因決定的。肺結核與細胞免疫密切相關。現代免疫學證實，T細胞受體-抗原肽-主要組織相容性復合體構成的三分子復合體是特異性細胞免疫應答的分子基礎。因此，HLA與肺結核的相關性研究成為目前結核病研究領域的一個熱點。

目前對于HLA基因與肺結核相關聯的確切發生機理尚不完全清楚，普遍認為入侵的結核菌在巨噬細胞內得以繁殖生長，其抗原經由溶菌酶的處理或因巨噬細胞死亡而釋出，通過HLA-Ⅱ類分子進行抗原呈遞給輔助性T淋巴細胞(CD4+)表面特殊的淋巴細胞受體，使之致敏，并繁殖形成單克隆細胞系。當再次受抗原攻擊時，淋巴細胞便產生多種淋巴因子，包括巨噬細胞和淋巴細胞趨化因子(CF)、巨噬細胞激活因子特別是干擾素-γ(INF-γ)、白細胞介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α和-β(TNF-α和TNF-β)，以及移動抑制因子(MIF)、有絲分裂因子(MF)、淋巴細胞轉移因子(LTF)等，從而導致單核細胞趨化、留駐局部、激活、分裂繁殖以及未致敏直接轉化為致敏淋巴細胞。同時研究還發現在CD4+細胞介導抗結核免疫反應過程中，抑制性T淋巴細胞(CD8+)也參與作用。這種作用通過HLA-Ⅰ類分子遞呈。它溶解已吞噬結核菌和受抗原作用的巨噬細胞，使結核菌釋放和擴散；它亦使宿主細胞溶解，造成組織破壞。另一方面，藏匿在宿主某些細胞中不能被殺滅的結核菌借助CD8+細胞對靶細胞的溶解作用而釋放，進而為鄰近部位具有高度殺菌活力的巨噬細胞吞噬和消滅[7-8]。

本研究顯示：①HLA-DR15基因突變型可能是肺結核發病易感基因型；②DR15位點突變如果與DR16位點突變同時存在時，兩基因聯合作用可能具有協同作用，能顯著增加結核病的易感性；③卡痕、BMI、結核病家族史可能是肺結核發病的危險因素。這與朱紅[3]等研究的結果不同，這可能與研究目標人群及對照組的選擇有關。

隨著人類基因組計劃的完成和后基因組時代的到來，越來越多的結核易感基因，如VDR(vitamin D receptor)基因、MBL(mannose binding lectin)基因和HLA (human leukocyte antigen)基因等被發現，而基因組流行病學研究的開展將使這些易感基因在不同人群中的分布、它們對疾病發生所起的作用及基因與基因間和基因與環境間的交互作用被逐步闡明。這有助于肺結核高危人群的預測，為優選干預措施(醫學干預、行為干預或環境干預)提供科學依據。

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Relationship between HLA-DRB1 Gene Polymorphisms and Susceptibility of Pulmonary Tuberculosis in Patients with Type 2 Diabetes Mellitus:124 Case-control Study

WANG Yu-hua,WANG Yu-xun,AN Ya-chen,et al.Department of Neurology,Affiliated Hospital,Hebei United University,Tangshan 063000,Hebei,China

ObjectiveTo investigate the association between the HLA-DRB1 gene polymorphisms and susceptibility of pulmonary tuberculosis(TB)in patients with type 2 diabetes mellitus in North China.MethodsA 1∶1 matched case-control study was adopted.Polymerase chain reaction-sequence-specific primers techniques(PCR-SSP)and restriction fragment length polymorphism(RFLP)was used to type polymorphisms(DR15,DR16,DR1,DR11).Information on environmental-related risk factors and pathological changes of tuberculosis was collected using a pre-tested standard questionnaire.Variance analysis,Chi-square,univariate and multivariate conditional Logistic analysis were conducted with SPSS 12.0 for Window.ResultsA sample of 124 pairs of cases and controls was studied.Univariate analysis demonstrated that DR15 mutant increased the risk of susceptibility of pulmonary tuberculosis(OR＝2.461,95%CI:1.363～4.444,P=0.002), and it would further increased if DR16 mutant occurred together(OR=4.904,95%CI:1.554～15.476).In multivariate analysis,DR15 mutant also associated with susceptibility of pulmonary tuberculosis(OR=2.996,95%CI:1.51～5.945).ConclusionPolymorphism of DR15 genotype might be a susceptible genotype of TB patients with type 2 diabetes mellitus in North China.

tuberculosis;pulmonary;diabetes;HLAgene;polymorphism;case-control study

R587.1

A

1006-9771(2013)06-0561-04

河北聯合大學博碩科研基金(No.BS05010)。術，從遺傳學角度探討HLA基因多態性與我國北方漢族成年糖尿病患者并發肺結核的關系，為我國結核病防治提供新的思路。

2013-01-04

2013-03-20)

1.唐山市結核病醫院，河北唐山市063000；2.河北聯合大學，河北唐山市063000；3.唐山市協和醫院，河北唐山市063000。作者簡介：王育華(1970-)，女，漢族，河北樂亭縣人，副主任醫師，主要研究方向：結核病內科學。通訊作者：安雅臣。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.06.017

[本文著錄格式]王育華，王玉潯，安雅臣，等.HLA-DRB1基因多態性與糖尿病并發肺結核易感性的研究[J].中國康復理論與實踐,2013,19(6):561-564.

糖尿病是由不同原因引起的人體內胰島素絕對不足或相對不足，以致糖、脂肪和蛋白質代謝發生障礙，而引起以高血糖為共同特征的臨床綜合征。中國糖尿病患者總數超過歐洲和美國糖尿病患者的總和，到目前為止估計有3000萬，居世界第二位[1]。由于糖尿病患病率增加、結核發病“回潮”(發達國家)和控制不良(發展中國家)，糖尿病并發結核病人數也逐年增多，糖尿病患者中肺結核的發生率是正常人的4～8倍[2]。而糖尿病又是肺結核重要的相關性疾病，糖尿病患者是結核病的易感者，而結核病又是誘發、加重糖尿病發生酮癥酸中毒等急性并發癥的重要常見的原因之一[3]。因此，兩病的并發一直是臨床醫師所關注的重要課題。本研究采用1∶1配對病例對照研究設計，利用聚合酶鏈反應-特異性引物序列(PCR-SSP)技