改良固相萃取高效液相色譜法測定人血清中萬古霉素濃度

宋新文 汪洋 許瓊 劉炘 彭靜

（武漢市婦女兒童醫療保健中心藥學部，湖北 武漢430016）

改良固相萃取高效液相色譜法測定人血清中萬古霉素濃度

宋新文 汪洋 許瓊 劉炘 彭靜

（武漢市婦女兒童醫療保健中心藥學部，湖北 武漢430016）

目的：建立高效液相色譜法測定人血清中萬古霉素濃度的方法。方法：以Hypersil C18柱（4.6 mm× 200 mm，10 μm）為色譜柱，流動相為乙腈-磷酸二氫鉀緩沖液（9∶91），流速為0.8 mL/min，檢測波長236 nm。血清樣品采用固相萃取柱，以含20%乙腈的磷酸二氫鉀溶液為洗脫劑，收集洗脫液直接進樣測定。結果：萬古霉素血清樣品線性范圍為0.8～120 mg/L，低、中、高3種不同濃度（4.33、19.40、77.60 mg/L）回收率分別為100.23%、102.11%、95.68%，日內、日間RSD均小于5%。結論：該方法準確性好、靈敏度高、操作簡便，可滿足臨床萬古霉素血藥濃度檢測的需要。

萬古霉素；固相萃取；高效液相色譜法；人血清

萬古霉素（Vancomycin）屬糖肽類抗生素，臨床上主要用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的治療[1]。為保證用藥的安全性和有效性，減少耐藥菌的產生，臨床上往往需要檢測其血藥濃度，根據血藥濃度檢測結果調整用藥方案[2]。因此，建立一種簡便、快速、準確的檢測萬古霉素血藥濃度方法具有十分重要的臨床意義。目前國內臨床上測定萬古霉素血藥濃度主要是通過蛋白沉淀法處理血清樣品，取上清液直接進入高效液相色譜儀進行檢測[3-5]。蛋白沉淀法處理血清樣品具有快速、簡便的特點，但由于血清蛋白沉淀不完全，大批次檢測容易堵塞高效液相色譜儀管路。此外，加入的蛋白沉淀劑對血清樣品的稀釋作用以及蛋白沉淀物對萬古霉素的吸附作用使得其提取回收率較低。張文娟等[6]建立了固相萃取（SPE）處理血清樣品，高效液相色譜儀檢測血清中萬古霉素濃度的方法，但該方法所采取的洗脫液（10%冰醋酸-甲醇溶液）需在氮氣流下水浴蒸干，實際操作中費時較長。本研究在此基礎上通過改變固相萃取洗脫液成分，建立了一種快速、穩定、準確的萬古霉素血藥濃度檢測方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀，包括G1311C二元色譜泵、G1316A柱恒溫箱（TCC）、G1315D二極管陣列檢測器（DAD）、Agilent1260化學工作站；WH-1微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；LDZ4-0.8A臺式離心機（北京醫用離心機廠）；AB204萬分之一電子分析天平（瑞士）；Cleanert C18-SPE柱（規格：200 mg/支，批號：BL0061L0709）。

1.2 試藥

萬古霉素對照品（原中國藥品生物制品檢定所，批號 130360-200301）；乙腈（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司，批號T20100423）；無水磷酸二氫鉀（北京益利精細化學品公司，批號0902020）；磷酸（天津市福晨化學試劑廠，批號 070425）；正常空白人血清（實驗室自制）；0.9%氯化鈉注射液（武漢濱湖雙鶴藥業有限責任公司，批號100704-201）；20%乙腈-磷酸二氫鉀溶液（配制方法：取色譜乙腈 20 mL與 80 mL磷酸二氫鉀緩沖液混合）；滅菌注射用水（安徽雙鶴藥業有限責任公司，批號11070920）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil C18（4.6 mm×200 mm，10 μm）；流動相為乙腈-磷酸二氫鉀緩沖液（9∶91）（取磷酸二氫鉀6.805 g，加入超純水到1 000 mL使溶解，最后用磷酸調節 pH至 3.2左右，0.45 μm微孔濾膜過濾），流速 0.8 mL/min；柱溫 25℃；檢測波長為236 nm；進樣量20 μL。

2.2 標準溶液的制備

精密稱取萬古霉素對照品12.4 mg于10 mL量瓶中，加滅菌注射用水制成1 240 mg/L儲備液，再用滅菌注射用水稀釋儲備液，配制濃度為9.70、19.38、38.75、77.50、155.00、310.00、620.00 mg/L系列標準水溶液。

2.3 血清標本的處理

取血清樣品0.5 mL置SPE小柱，待自然瀝干后用0.9%氯化鈉注射液2 mL上柱進行淋洗，棄去淋洗液，將SPE小柱于3 000 r/min離心1 min，精密量取 1 mL 20%乙腈-磷酸二氫鉀溶液上柱進行洗脫，收集洗脫液，取 20 μL直接進樣測定。

2.4 標準品和血清樣品色譜圖

分別取空白血清樣品、含萬古霉素血清樣品及標準品進樣測定，記錄色譜圖，見圖1。結果顯示色譜峰與血清中內源性雜質峰很好分離，無干擾峰出現，萬古霉素的保留時間為11 min左右。

圖1 萬古霉素血清樣品色譜A空白血清 B含萬古霉素血清樣品 C萬古霉素標準液

2.5 線性關系考察

取空白血清1.0 mL，依次加入萬古霉素系列標準水溶液及儲備液0.1 mL，配制成萬古霉素濃度分別為 0.88、1.76、3.52、7.04、14.09、28.18、56.36、112.72 mg/L的系列血清樣品。取以上血清樣品，按1.3項下的方法操作，取20 μL進樣測定，記錄色譜圖，以樣品的濃度（C）對峰面積（A）進行線性回歸，得回歸方程

C=0.117 2 A－0.205 2（r=0.999 1）

結果表明，萬古霉素血藥濃度在0.8～120 mg/L范圍內線性關系良好，最低定量濃度為0.8 mg/L。

2.6 方法學回收率及精密度試驗

取空白血清1.0 mL，加入0.1 mL萬古霉素對照水溶液，配制成低、中、高濃度分別為 4.33、19.40、77.60 mg/L萬古霉素血清樣品各5份。按2.3項下的方法操作，連續測定3 d，以標準曲線方程計算樣品實測濃度，與配制濃度比較，計算低、中、高各濃度方法學回收率及其日內、日間精密度。結果見表1。

表1 萬古霉素血清方法學回收率

2.7 臨床標本檢測結果

10例化膿性關節炎患兒，其中，男7例，女3例；年齡最小27天，最大9歲1個月，分別按40mg/kg.d，分3～ 4次，靜脈滴注的用藥方案治療3 d后采集靜脈血測定萬古霉素血清峰濃度（靜脈滴注完畢后60 min采血）及谷濃度（下次給藥前5～10 min采血），結果見表2。

表2 10例化膿性關節炎患兒萬古霉素血清濃度

3 討論

本研究在實驗過程中分別采用 10%、20%、 30%乙腈-磷酸二氫鉀溶液作為洗脫劑。結果發現，10%乙腈-磷酸二氫鉀溶液的洗脫能力有限，只能將約10%的萬古霉素從SPE柱上洗脫，20%及30%乙腈-磷酸二氫鉀溶液洗脫能力較好，可以將萬古霉素完全洗脫。但30%乙腈-磷酸二氫鉀溶液作為洗脫液，由于乙腈含量較高，所得色譜峰形前延現象嚴重，影響峰面積準確積分。Backes DW等[7]和Farin D等[8]分別采用0.05 M磷酸二氫鉀-乙腈（30∶70）及0.05 M磷酸二氫鉀-乙腈（50∶50）作為洗脫劑，這兩種洗脫劑同樣存在乙腈含量較高問題，故本研究采用20%乙腈-磷酸二氫鉀溶液作為洗脫液。實驗表明，所得色譜峰形對稱性良好，符合實驗要求。宋新文等[9]曾采用20%偏磷酸作為蛋白沉淀劑純化血樣測定萬古霉素血清濃度，但由于蛋白沉淀物對萬古霉素的部分吸附及內源性雜質干擾，該方法的最低檢測限只能達2 mg/L，對于萬古霉素血清谷濃度的檢測有一定的局限性。本研究采用SPE法純化血樣，內源性雜質去除干凈，將最低檢測濃度提高到0.8 mg/L，尤其適合萬古霉素血清谷濃度的測定。

SPE高效液相色譜法測定萬古霉素血藥濃度國內少有報道，國外文獻[7-8，10]報道多采用洗脫液蒸干復溶后進樣測定，實際操作中洗脫液蒸干極為困難，耗時較長。張文娟等[6]曾采用洗脫液（10%醋酸-甲醇溶液作為洗脫劑）蒸干復溶后進樣測定，但耗時較長，需40～60 min才能將洗脫液蒸干。考慮到萬古霉素血清峰濃度和谷濃度比較高，用2倍于血清量的洗脫液將萬古霉素從SPE柱上洗脫后直接進樣，雖然進樣濃度稀釋了1倍，但仍可被高效液相色譜儀檢測出來，故本研究采用洗脫液直接進樣測定，該方法簡便、快速、準確，可以滿足萬古霉素血藥濃度監測和藥動學研究的需求。

[1] 李家泰.臨床藥理學[M].3版.北京：人民衛生出版社，2007：1024-1027.

[2] 萬古霉素臨床應用中國專家共識 （2011版）[J].中國新藥與臨床雜志，2011，30（8）：561-573.

[3] 蔣碩民，戚雙雙，王增壽.高效液相色譜法測定人血漿中萬古霉素的濃度[J].中國醫院藥學雜志，2006，26（11）：1364-1366.

[4] 張虹，方昱，李英，等.反相高效液相色譜法測定臨床聯合用藥時血漿中萬古霉素濃度[J].藥物分析雜志，2008，28（4）：591-594.

[5] 林玉仙，蘇煌財.高效液相色譜法測定萬古霉素的血藥濃度[J].中國醫院藥學雜志，2009，29（8）：637-639.

[6] 張文娟，宋新文，汪洋，等.固相萃取高效液相色譜法測定萬古霉素血藥濃度[J].中國臨床藥理學雜志，2011，27（2）：149-151.

[7] Backes DW，Aboleneen HI，Simpson JA.Quantitation of vancomycin and its crystalline degradation product（CDP-1）in humanserumbyhighperformanceliquidchromatography[J].JPharm Biomed Anal，1998，16（8）：1281-1287.

[8] Farin D，Piva GA，Gozlan I，et al.A modified HPLC method for the determination of vancomycin in plasma and tissues and comparison to FPIA（TDX）[J].J Pharm Biomed Anal，1998，18（3）：367-72.

[9] 宋新文，許瓊，汪洋，等.HPLC法測定人血清中萬古霉素的濃度[J].中國藥房，2010，21（18）：1663-1665.

[10] Zhang T，Watson DG，Azike C，et al.Determination of vancomycin in serum by liquid chromatography-high resolution full scan mass spectrometry[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2007，857（2）：352-356.

Determination of the Concentration of Vancomycin in Human Serum by Modified Solid Phase Extraction and HPLC

Song Xinwen，Wang Yang，Xu Qiong，Liu Xin，Peng Jing （Pharmaceutical Department of Wuhan Medical Care Center for Women and Children，Hubei Wuhan 430016，China）

Objective：To establish a high performance liquid chromatography method for the determination of the concentration of vancomycin in human serum.Methods：The analysis was conducted with Hypersil C18column (4.6 mm× 200 mm，10 μm).Acetonitrile-potassium dihydrogen phosphate （9∶91）was served as mobile phase，the flow rate was 0.8 mL/min，and the detecting wavelength was at 236 nm.Serum sample was applied to solid phase extraction column.Taking the potassium dihydrogen phosphate solution containing 20%acetonitrile as eluent，and collecting the eluent which was determined by direct injection.Results：The linear range of vancomycin in serum was 0.8～120 mg/L.The recovery rate of low，moderate and high concentrations（4.33，19.40，77.60 mg/L）was 100.23%，102.11%，95.68%respectively.Both intra-day and inter-day RSDs were less than 5%.Conclusion：This method is accurate，sensitive，and simple.It is suitable for the determination of the concentration of vancomycin in human serum.

Vancomycin；Solid Phase Extraction；High Performance Liquid Chromatography；Human Serum

10.3969/j.issn.1672-5433.2013.02.005

宋新文，男，副主任藥師。研究方向：臨床藥學。通訊作者E-mail：13797028603@126.com