不同產(chǎn)地刺五加不同部位多糖含量測定

霍文 勞鳳云 姚熠辰

（河北聯(lián)合大學(xué)，河北唐山063000）

不同產(chǎn)地刺五加不同部位多糖含量測定

霍文 勞鳳云 姚熠辰

（河北聯(lián)合大學(xué)，河北唐山063000）

目的：測定不同產(chǎn)地刺五加不同部位的多糖含量。方法：采用微波提取法提取刺五加中的多糖，考察微波提取時(shí)間、料液比、提取功率3個(gè)因素對多糖提取率的影響，確定最佳提取條件，并采用苯酚-硫酸法測定其含量。結(jié)果：微波提取法提取刺五加中多糖的最佳條件為提取功率700 W，料液比1∶30，作用時(shí)間120 s；刺五加根部及莖部多糖含量均以本溪產(chǎn)最高，穆枝產(chǎn)次之，琿春產(chǎn)最低。結(jié)論：用微波提取法提取刺五加中的多糖具有快速、高效、節(jié)能、不破壞有效成分等特點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景；苯酚-硫酸法簡便、快速、準(zhǔn)確，可作為刺五加多糖的含量測定方法；不同產(chǎn)地、不同部位刺五加藥材的多糖成分的含量不同。

刺五加；多糖；微波提取；含量測定

刺五加為五加科植物刺五加 Acanthopanax senticosi（Rupr.et Maxim）Harms的干燥根及根莖或莖，有益氣健脾、補(bǔ)腎安神的功效[1]，主要分布在中國東北、華北、俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)及日本北海道、朝鮮等地[2]。刺五加多糖（Acathopanax senticosus Polysacharides，ASPS）為其免疫活性組分，包括葡萄糖、果糖、阿拉伯糖等，是理想的免疫增強(qiáng)劑[2-3]。本研究以不同產(chǎn)地的刺五加根、莖為原料，采用微波提取法提取刺五加多糖，確定提取的最佳工藝條件，并對其多糖含量進(jìn)行測定，為刺五加質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定及刺五加多糖藥物及功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

微波催化合成/萃取儀XH100B（北京翔鵠科技發(fā)展有限公司），TU-1810紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司），SHZ-D/Ⅲ型循環(huán)水真空泵（上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），F(xiàn)A1004電子天平（上海精科天平），HHS-電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠）等。

1.2 藥材

刺五加藥材根、莖，產(chǎn)地分別為黑龍江穆枝、遼寧本溪、吉林琿春。以上藥材粉碎后過40目篩。葡萄糖、苯酚、硫酸，均為國產(chǎn)分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 對照品溶液的制備[4]

精密稱定干燥至恒重的葡萄糖 100 mg于100 mL量瓶中稀釋至刻度。精密量取 10 mL于100 mL量瓶中稀釋至刻度，搖勻，配制成0.1 mg/mL的葡萄糖對照品溶液，備用。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取刺五加干燥粉末1 g于平底燒瓶中，放入微波萃取儀內(nèi)，按料液比 1∶30加入蒸餾水，在微波功率700 W下提取2 min，減壓抽濾得濾液。精密量取濾液1 mL于25 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，制成供試品溶液，備用。

2.3 測定波長選擇[5]

以一定濃度葡萄糖對照品溶液，采用苯酚-硫酸顯色法，在波長450～ 550 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。以最大吸收波長作為刺五加多糖的吸收波長進(jìn)行測定。

2.4 線性關(guān)系考察[6-7]

精密量取對照品溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mL置于具塞試管中，分別加蒸餾水至2 mL，加入1 mL 5%苯酚溶液，沿壁迅速加入5 mL濃硫酸，迅速搖勻，放置10 min后，在30℃水浴恒溫20 min取出，冷卻至室溫，另以2.0 mL的蒸餾水同樣操作，作空白對照，在最大吸收波長處測定吸光度（A）值。以葡萄糖濃度（C）為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5 刺五加多糖提取的單因素實(shí)驗(yàn)

2.5.1 提取時(shí)間對刺五加多糖提取量的影響

精密稱取4份干燥刺五加粉末 1.0 g于平底燒瓶中，按料液比1∶30加入蒸餾水，選擇微波功率 700 W，在微波萃取儀中分別作用 60、90、120和150 s，減壓抽濾，得濾液。精密量取濾液1 mL加入25 mL量瓶中，加蒸餾水定容，搖勻。精密量取上述溶液 2 mL，按2.4項(xiàng)下方法操作，在最大吸收波長處測定A值。

2.5.2 料液比對刺五加多糖提取的影響

精密稱取4份干燥刺五加粉末 1.0 g，按料液比1∶20、1∶25、1∶30和1∶35加入蒸餾水，于微波萃取儀中作用120 s，按照2.5.1項(xiàng)下方法操作，測定A值。

2.5.3 提取功率對刺五加多糖提取的影響

精密稱取干燥刺五加粉末1.0 g，按料液比1∶30加入蒸餾水，功率分別設(shè)定為400、500、600、700、800和 850 W，于微波萃取儀中作用 120 s，按照2.5.1項(xiàng)下方法操作，測定A值。

2.6 樣品含量測定

精密稱取不同產(chǎn)地不同部位的干燥刺五加粉末 1.0 g，按一定料液比，一定作用時(shí)間，一定微波功率進(jìn)行微波提取后進(jìn)行減壓抽濾，得濾液。精密量取濾液1 mL加入25 mL量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻。精密量取上述溶液2 mL，加入1 mL 5%苯酚，沿壁迅速加入5 mL濃硫酸，迅速搖勻，放置10 min后，在30℃水浴恒溫20 min取出，冷卻，在最大吸收波長處測定A值。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 測定波長選擇

根據(jù)葡萄糖對照品溶液在450～550 nm波長范圍內(nèi)的掃描結(jié)果，測得最大吸收波長為490 nm。

3.2 線性關(guān)系考察結(jié)果

將一系列不同濃度葡萄糖對照品溶液，采用苯酚-硫酸顯色法，測定吸光度，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程

A=0.010 7C－0.076 5

r=0.999 9（n=6），線性范圍為10～60 μg/mL。

3.3 刺五加多糖提取單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析

3.3.1 提取時(shí)間對刺五加多糖提取量的影響

用微波萃取儀提取時(shí)，提取時(shí)間60～ 120 s范圍內(nèi)時(shí)，刺五加的多糖提取量均隨提取時(shí)間的延長而明顯增加，提取時(shí)間為120 s時(shí)提取量最大；而提取時(shí)間超過 120 s后，多糖提取量下降，見圖1。原因可能是刺五加中可溶性多糖發(fā)生水解，同時(shí)刺五加中的其他雜質(zhì)成分也被提取出來。確定120 s為刺五加多糖提取的最佳提取時(shí)間。

圖1 提取時(shí)間對刺五加多糖提取量的影響

3.3.2 料液比對刺五加多糖提取量的影響

料液比逐漸增大時(shí)，多糖提取量逐漸增大，見圖2。當(dāng)料液比為1∶30時(shí)，多糖提取量最大；超過1∶30時(shí)，多糖提取量又會降低。確定1∶30為刺五加多糖提取的最佳料液比。

圖2 料液比對刺五加多糖提取量的影響

3.3.3 提取功率對刺五加多糖提取的影響

不同提取功率對刺五加多糖提取有較大影響。隨功率的逐漸增大，刺五加多糖含量逐漸增多。微波功率700 W時(shí)，多糖提取量最大，見圖3。

可知刺五加藥材中刺五加多糖的最佳提取條件為料液比1∶30，提取功率700 W，提取時(shí)間120 s。

圖3 提取功率對多糖提取量的影響

3.4 精密度試驗(yàn)

精密量取供試品溶液2 mL各5份，按照2.5.1項(xiàng)下方法操作顯色，測定A值，RSD=0.399 7%（n=6）。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，按2.5.1項(xiàng)下方法操作顯色，每隔 10 min測定吸光度，結(jié)果表明供試品溶液顯色后在 60 min內(nèi)穩(wěn)定，RSD=0.586%（n=6）。

3.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取干燥刺五加粉末1.0 g，按料液比1∶30，提取功率700 W，提取120 s，減壓抽濾，得濾液，精密量取1 mL，分別加入0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL，按照2.5.1項(xiàng)下方法操作顯色，測定A值，計(jì)算平均加樣回收率，見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.7 樣品含量測定

精密稱定刺五加根或莖干燥粉末1.0 g，按最佳提取條件，料液比1∶30加入蒸餾水，在微波功率700 W下提取120 s，減壓抽濾得濾液。精密量取濾液1 mL，按2.5.1項(xiàng)下方法操作顯色，測得A值，計(jì)算多糖含量。不同產(chǎn)地刺五加根、莖的多糖含量見表2。

4 結(jié)論與討論

4.1 刺五加多糖提取的最佳條件是提取時(shí)間120 s，料液比1∶30，提取功率700 W。

表2 不同產(chǎn)地刺五加根、莖的多糖含量（mg/g）

4.2 本溪產(chǎn)刺五加莖部多糖含量最多，穆枝次之，琿春最少；而根部多糖含量亦為本溪最多，穆枝次之，琿春最少。可見不同產(chǎn)地、不同部位刺五加藥材多糖成分的含量是不同的。在使用刺五加藥材時(shí)，應(yīng)考慮產(chǎn)地等多方面因素，合理選擇，以便更好發(fā)揮療效。

4.3 微波是一種非電離的電磁輻射，被輻射物質(zhì)的極性分子在微波電磁場中快速轉(zhuǎn)向及定向排列，從而產(chǎn)生斷裂和相互摩擦引起發(fā)熱，同時(shí)可以保證能量的快速傳遞和充分利用。超聲波是一種高頻機(jī)械波，超聲場具有波動效應(yīng)、微擾效應(yīng)、界面效應(yīng)和聚能效應(yīng)等。微波與超聲的協(xié)同作用，利于破壁、組分釋放等，因此，微波提取中藥成分的效率要高于常規(guī)提取法[8]。與常規(guī)方法比較，微波提取多糖具有提取時(shí)間明顯縮短、提取率顯著提高等優(yōu)勢，可有效避免刺五加多糖的分解，所用儀器簡單，操作方便。

4.4 本研究采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，苯酚-硫酸試劑可與游離的或多糖中己糖、糠醛酸發(fā)生顯色反應(yīng)，在490 nm波長處有最大吸收，且吸光度與糖含量呈線性關(guān)系[9]。有研究[10-11]曾采用該法測定艾葉多糖含量和紅曲霉多糖含量。在用苯酚-硫酸測定多糖含量時(shí)，苯酚須臨用現(xiàn)配，遮光冷藏。若苯酚被氧化，可重新蒸餾。本方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠，簡便、快速，可作為刺五加多糖含量的測定方法。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2010年版）一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：559-561.

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Content Determination of Polysaccharides of Radix Acanthopanacis Senticosi from Different Sources

Huo Wen，Lao Fengyun，Yao Yichen（Hebei United University，Hebei Tangshan 063000，China）

Objective:The polysaccharide contents of different parts of radix acanthopanacis senticosi from different sources were studied.Methods:Polysaccharides of radix acanthopanacis senticosi were extracted by microwave. The optimal conditions of polysaccharide extraction were determined including the microwave extraction time，the ratio of material to liquid and extraction power，which were the influencing factors to the extraction rate of polysaccharides.The polysaccharide content was determined by the phenol-sulfuric acid method.Results:The best conditions to extract polysaccharides from radix acanthopanacis senticosi were at 1∶30 ratio of material to liquid under 700 W microwave power for 120 s.Radix acanthopanacis senticosi from Benxi showed the highest polysaccharide contents in both root and stem，and less and least polysaccharide contents showed from Muzhi and Hunchun respectively.Conclusion:The microwave extraction of polysaccharides from radix acanthopanacis senticosi exhibited the advantages of better extraction rate，high efficiency，less energy consumption，and without destroying the effective contents.This method showed a good application prospect for the content extraction.The phenol-sulfuric acid method was proved simple，rapid and accurate for the content determination of polysaccharides.The polysaccharide contents of different parts of radix acanthopanacis senticosi from different sources were varied.

Radix Acanthopanacis Senticosi；Polysaccharide；Microwave Extraction；Content Determination

10.3969/j.issn.1672-5433.2013.02.006

2012-09-05）

唐山市科學(xué)研究與發(fā)展計(jì)劃——刺五加中不同部位藥用成分的分離及含量測定（11150204A-4）

霍文，女，碩士，教授。研究方向：中藥有效成分分析。通訊作者E-mail：huowen829@sohu.com