不同反膠束體系后萃取花生蛋白質的比較

高艷秀 陳復生 郭 珍 楊穎瑩 李潤潔

(河南工業大學糧油食品學院，鄭州 450001)

花生是世界上主要的優質食用植物油料品種之一，花生籽仁的主要成分是蛋白質、脂肪和碳水化合物，其含量分別為24%～36%、50%左右和10%～23%[1]?；ㄉ鞍撞粌H所含氨基酸種類比較齊全，而且所含人體必須氨基酸的比例較高[1]。目前，國內外花生加工普遍基于油脂為中心，因此花生中蛋白的利用率較低。傳統的堿溶酸沉法生產的花生蛋白純度不高，且蛋白質萃取率較低[2]。Luisi等[3]首次提出用反膠束萃取蛋白質的概念；Leser[4]等利用AOT/異辛烷體系萃取分離大豆和向日葵中的油和蛋白質。在國內，孫秀平等[5]對 AOT、SDS、CTAB和TritonX－100 4種表面活性劑所形成的反膠束體系萃取花生蛋白進行了研究，結果表明:不同的表面活性劑，所形成的反膠束“水池”大小不同，蛋白質萃取率也不同，表面活劑性的濃度對蛋白萃取率有直接的影響。

本試驗研究AOT、SDS、DTAC 3種反膠束體系萃取花生蛋白質的最佳后萃工藝條件，通過色差分析，從宏觀上比較不同花生蛋白產品色澤的差異，進一步通過對比3種不同花生蛋白質的掃描電鏡照片，分析其微觀結構的差異，以期找到最適合萃取花生蛋白的反膠束體系，為工業化應用提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全脂花生粉(過60目篩):河南帝鑫食品有限公司，將花生仁經過短時翻炒去紅衣(保證蛋白未變性的條件下)，然后粉碎。

二—(2－乙基己基)琥珀酸酯磺酸酯(AOT):上海海曲化工廠；十二烷基硫酸鈉(SDS)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀:天津市科密歐化學試劑有限公司；十二烷基三甲基氯化銨(DTAC):廈門市先端科技有限公司；卡爾費休液:天津市科密歐化學試劑開發中心；異辛烷、正辛醇、正庚烷、正己醇:天津市博迪化工有限公司。

1.2 儀器和設備

GL－20L高速冷凍離心機:上海安亭科學儀器有限公司；ZSD－2J自動水分滴定儀:上海安亭電子儀器廠；pH211酸度計:意大利HANNA；BS210S電子天平:Sartorius，German；THZ－82B氣浴恒溫振蕩器:江蘇省金壇市瑞華儀器廠；移液槍:Eppendof公司；UV－1901紫外分光光度計:北京普析通用儀器有限責任公司；KQ－250B超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司；90－2恒溫磁力攪拌器:上海亞榮生化儀器廠；LGJ－18冷凍干燥機:北京四環科學儀器廠；CR－400色彩色差計:日本柯尼卡美能達；JSM－5610掃描電鏡:日本電子株式會社。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料的主要成分分析

蛋白質含量測定，GB/T 5009.5—2003；油脂含量測定，GB/T 5009.6—2003；水分含量測定，GB/T 5009.3—2003。

1.3.2 蛋白質標準曲線的制作

以牛血清蛋白為標準，紫外分光光度計測定不同濃度標準蛋白液在280 nm處吸光值，以蛋白質濃度為橫坐標，對應吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.3 反膠束溶液的配制

AOT反膠束體系的配制:稱取一定量AOT，置于100 mL錐形瓶中，同時加入有機溶劑異辛烷，在磁力攪拌器上攪拌至AOT完全溶解，待溶液透明后，加入適量(0.02～0.20 mL/mL)含 0.2 mol/L KCl的KH2PO4－Na2HPO4緩沖溶液，搖床振蕩，室溫下靜置12 h，若溶液透明則為反膠束體系(溶液底部有少量水不影響[6])；反之則不是，需要重復上述步驟重新配制，直至溶液透明[7]。

SDS反膠束體系的配制:稱取一定量SDS，置于100 mL錐形瓶中，同時加入有機溶劑異辛烷/正辛醇(體積比4∶1)和適量(0.02～0.20 mL/mL)含 0.25 mol/L KCL的 KH2PO4－Na2HPO4緩沖溶液，超聲波振蕩至SDS完全溶解，溶液透明則為反膠束體系；反之則不是，需要重復上述步驟重新配制，直至溶液透明。

DTAC反膠束體系的配制:稱取一定量DTAC，置于100 mL的錐形瓶中，同時加入有機溶劑正庚烷/正己醇(體積比4∶1)和適量(0.02～0.20 mL/mL)含0.05 mol/L KC1的 KH2PO4－Na2HPO4緩沖溶液，超聲波振蕩至DTAC完全溶解，溶液透明則為反膠束體系；反之則不是，需要重復上述步驟重新配制，直至溶液透明。

1.3.4 Karl－fischer法測定反膠束體系的W0值

利用自動水分滴定儀，在滴定瓶中加入適量的無水甲醇(甲醇液面要超過電極的鉑片，約20～30 mL)，用卡爾費休氏溶液將甲醇中的水分滴去，然后再用微量進樣器準確向甲醇溶液中加入10μL蒸餾水，再用卡爾費休氏溶液滴至終點，以標定卡爾費休氏溶液的滴定度，重復標定3次以上。用微量注射器吸取待測反膠束溶液50μL，迅速加入到滴定瓶中，用卡爾費休氏溶液滴定至終點，讀取反膠束溶液中所含水分的體積[8]。W0值為反膠束中的水分含量的摩爾數與表面活性劑的摩爾數之比。

式中:W0為反膠束溶液中增溶水和表面活性劑的摩爾比率。

1.3.5 前萃試驗

取按1.3.3節配制好的反膠束溶液置于錐型瓶中，按照表1中的前萃條件，加入一定量花生粉(精確到0.000 1 g)，在一定的超聲溫度、超聲功率條件下，超聲一定時間，然后以約3 000 r/min的轉速離心分離10 min。萃取體系分為2層，上層為萃入蛋白質的反膠束層，下層為殘渣，除去殘渣，所得上清液用UV－1901紫外分光光度計在280 nm波長下測定吸光度(以萃取前的反膠束溶液作為空白樣)，然后與蛋白質標準曲線比對，得出蛋白質的濃度，計算出不同條件下的蛋白前萃率[8]，蛋白前萃率按式(2)計算。

3種反膠束體系的前萃最優工藝條件見表1。

表1 3種反膠束體系的最優前萃工藝條件

1.3.6 后萃試驗

取一定體積前萃試驗制備的前萃液，加入等體積、一定KCl濃度、pH值的 KH2PO4－Na2HPO4緩沖溶液。在一定的溫度、功率條件下，超聲一定時間，然后在5 000 r/min條件下離心10 min，用梨形分液漏斗分液，下層水相即為后萃液。用UV－1901紫外分光光度計在280 nm波長下測定吸光度(以緩沖溶液作為空白樣)。然后與蛋白質標準曲線比對，得出蛋白質的濃度。從而可計算出蛋白后萃率[8]。蛋白后萃率按式(3)計算。

1.3.7 花生蛋白樣品的制備

AOT反膠束體系制備花生蛋白:按照1.3.5和1.3.6的方法計算不同反膠束體系萃取花生蛋白的前萃率和后萃率，然后用1.3.6制得的后萃液，用透析袋在4℃的條件下，透析48 h以上，其間換水6～8次，然后將透析好的蛋白質水溶液在冷凍干燥機上面冷凍干燥得到花生蛋白的產品。

SDS反膠束體系制備花生蛋白的步驟同AOT反膠束體系制備花生蛋白。

DTAC反膠束體系制備花生蛋白的步驟同AOT反膠束體系制備花生蛋白。

1.3.8 不同花生蛋白的色差分析

使用美能達色彩色差計CR－400測定蛋白樣品的色澤，以L*a*b*法表示蛋白的色澤。L*范圍為0～100(從黑到白，表示明度)，a*(從綠到紅，－a～＋a)，b* (從藍到黃，－b～＋b)。3個方向三維立體分別評價。每個樣品測定3次，測定L、a、b值，3次結果取平均值，并用SAS軟件進行顯著性分析。

1.3.9 不同花生蛋白的掃描電鏡顯微結構研究

采用掃描電子顯微鏡(SEM)方法觀察花生分離蛋白的微觀結構，并對不同方法制備的花生分離蛋白進行比較。直接取適量樣品，用雙面膠固定在載玻片上，在150Ao下噴金，通過JSM－5610掃描電鏡在20 KV觀察、照相。

2 結果與討論

2.1 原料主要成分測定結果

原料中主要成分及其含量見表2。

表2 原料主要成分及質量分數(%)

2.2 蛋白質定量分析標準曲線

繪制蛋白質標準曲線是為了得出蛋白質的濃度，從而可計算出不同條件下的蛋白前萃率。蛋白質定量分析標準曲線如圖1所示。

圖1 蛋白質定量分析標準曲線

2.3 緩沖溶液pH值對花生蛋白后萃率的影響規律研究

分別配制 pH為7、7.5、8、8.5、9、9.5的KH2PO4－Na2HPO4緩沖溶液，按照1.3.6進行操作。其中，AOT反膠束體系的后萃工藝條件設定為:超聲時間為40 min、超聲溫度40℃、超聲功率240 W、KCl濃度1.5 mol/L；SDS反膠束體系的后萃工藝條件設定為:超聲時間40 min、超聲溫度45℃、超聲功率270 W、KCl濃度1.5 mol/L；DTAC反膠束體系的后萃工藝條件設定為:超聲時間20 min、超聲溫度30℃、超聲功率270 W、KCl濃度1.5 mol/L。試驗結果如圖2所示。

圖2 緩沖溶液pH值對花生蛋白后萃率的影響

由圖2可以看出，隨著緩沖溶液pH值的增大，花生蛋白后萃率先逐漸增大，然后減小。AOT反膠束體系的最佳pH值為8.5，SDS和DTAC反膠束體系的最佳pH值都為9，此時蛋白后萃率達到最大。后萃取過程中，水相的pH值高于蛋白質的等電點(pI)，蛋白質所帶的電荷與反膠束內壁所帶的電荷性質相同，由于靜電斥力，使溶入反膠束的蛋白質反向萃取出來。且pH值越高蛋白質分子表面所帶電荷的密度越大，斥力越強，蛋白質從反膠束內釋放的速率越快，因此后萃率就越高。但是當pH值過高時，蛋白質易變性，會使蛋白質的萃取率降低。

2.4 超聲時間對花生蛋白后萃率的影響規律研究

將超聲時間分別設定為 10、20、30、40、50、60 min，按照1.3.6進行操作。其中，AOT反膠束體系的后萃工藝條件設定為:緩沖溶液pH值為8.5、超聲溫度40℃、超聲功率240 W、KCl濃度1.5 mol/L；SDS反膠束體系的后萃工藝條件設定為:緩沖溶液pH值為9、超聲溫度45℃、超聲功率270 W、KCl濃度1.5 mol/L；DTAC反膠束體系的后萃工藝條件設定為:緩沖溶液pH值為9、超聲溫度30℃、超聲功率270 W、KCl濃度1.5 mol/L。試驗結果如圖3所示。

圖3 超聲時間對花生蛋白后萃率的影響

由圖3可以看出，隨著超聲時間的延長，蛋白后萃率先逐漸增大，再迅速減小。兩種陰離子表面活性劑AOT和SDS形成的反膠束體系，最佳萃取時間為40 min，而陽離子表面活性劑DTAC形成的反膠束體系，最佳萃取時間為20 min，此時，蛋白后萃率達到最大值。很明顯，陽離子表面活性劑形成的反膠束最佳萃取時間低于陰離子的。這可能與表面活性劑本身的結構差異有關。

2.5 超聲溫度對花生蛋白后萃率的影響規律研究

將超聲溫度分別設定為25、30、35、40、45、50℃，按照1.3.6進行操作。其中，AOT反膠束體系的后萃工藝條件設定為:緩沖溶液pH值為8.5、超聲時間40 min、超聲功率240 W、KCl濃度1.5 mol/L；SDS反膠束體系的后萃工藝條件設定為:緩沖溶液pH值為9、超聲時間40 min、超聲功率270 W、KCl濃度1.5 mol/L；DTAC反膠束體系的后萃工藝條件設定為:緩沖溶液pH值為9、超聲時間20 min、超聲功率270 W、KCl濃度1.5 mol/L。試驗結果如圖4所示。

圖4 超聲溫度對花生蛋白后萃率的影響

由圖4可以看出，隨著萃取溫度的升高，蛋白后萃率先逐漸增大，達到某個特定溫度后，蛋白后萃率達到最大值，再繼續升高溫度，后萃率有所減小。其原因是溫度升高時，分子運動速率加快，反膠束與水相之間的分子運動也加快，傳質推動力增大，加快了蛋白質的萃取，因此萃取率升高。當溫度繼續升高，萃取率變化不大，此時萃取已經達到平衡，另外，溫度過高會導致蛋白變性。

2.6 超聲功率對花生蛋白后萃率的影響

將超聲功率分別設定為 150、180、210、240、270、300 W，按照1.3.6進行操作。其中，AOT反膠束體系的后萃工藝條件設定為:緩沖溶液pH值為8.5、超聲時間40 min、超聲溫度40℃、KCl濃度1.5 mol/L；SDS反膠束體系的后萃工藝條件設定為:緩沖溶液pH值為9、超聲時間40 min、超聲溫度45℃、KCl濃度1.5 mol/L；DTAC反膠束體系的后萃工藝條件設定為:緩沖溶液pH值為9、超聲時間20 min、超聲溫度30℃、KCl濃度1.5 mol/L。試驗結果如圖5所示。

圖5 超聲功率對花生蛋白后萃率的影響

由圖5可以看出，隨著超聲功率的增大，蛋白后萃率先逐漸增大然后減小。原因是在后萃過程中存在較大的界面阻力，使用超聲波可以起到強化作用，超聲波功率越大，空化作用和機械作用越強烈，分子擴散速度也就越大[9]，同時空化所產生的微射流會促進蛋白質向反膠束的表面擴散，降低了蛋白從反膠束中向水相中擴散的阻力，因此可以促進蛋白質的浸出和傳質，提高蛋白質的萃取率。但是，當超聲功率足夠大時，增加了全脂花生粉中油脂的運動，從而阻礙了蛋白質的滲出。

2.7 KCl濃度對花生蛋白后萃率的影響

分別配制 KCl濃度為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mol/L的 KH2PO4－Na2HPO4緩沖溶液，按照1.3.6進行操作。其中，AOT反膠束體系的后萃工藝條件設定為:緩沖溶液pH值為8.5、超聲時間40 min、超聲溫度40℃、超聲功率240 W；SDS反膠束體系的后萃工藝條件設定為:緩沖溶液pH值為9、超聲時間40 min、超聲溫度45℃、超聲功率270 W；DTAC反膠束體系的后萃工藝條件設定為:緩沖溶液pH值為9、超聲時間20 min、超聲溫度30℃、超聲功率270 W。試驗結果如圖6所示。

圖6 KCl濃度對花生蛋白后萃率的影響

由圖6可以看出，當KCl濃度逐漸增大的過程中，蛋白后萃率迅速增大，隨著KCl濃度繼續增大，蛋白后萃率逐漸減小，并趨于平穩。3種體系的最佳離子濃度均為1.5mol/L。這是由于隨著離子濃度的增大，反膠束內表面的雙電層變薄，靜電引力也就減弱；另一方面，減小了表面活性劑極性頭之間的排斥作用，導致反膠束變小[9]。這兩方面的效應都會使蛋白質在反膠束中的溶解性下降，更容易從反膠束中反萃出來，從而后萃率得到提高。但是KCl離子濃度越大，反膠束的W0值則會越小，使得反膠束極性核所包含的蛋白質隨著減少的水分而被帶出，故后萃率開始減?。涣硗?，鹽濃度過高時，對蛋白質會產生鹽析作用，也會導致蛋白質后萃率降低[10]。

2.8 驗證試驗

根據以上的研究可得到3種不同反膠束體系的后萃工藝條件，根據單因素試驗研究，并根據實際情況做適當調整，做重復驗證試驗。得到了3種反膠束體系萃取花生蛋白的最佳后萃工藝條件及后萃率，如表3所示。

表3 3種反膠束體系萃取花生蛋白的最佳后萃工藝條件

2.9 不同反膠束體系制備的花生蛋白樣品色差分析結果

如表4所示，不同花生蛋白的色差分析中，AOT反膠束體系制備的花生蛋白L值最大，a值最小，可見PPI2的色澤是最好的。不同反膠束體系制備的花生蛋白與堿溶酸沉法制備的相比，其L、a、b值都存在顯著性差異。通過表4中的數據可以看出，AOT反膠束制備的花生蛋白的色澤最好，而堿溶酸沉法制備的花生蛋白的色澤最差。

表4 不同花生蛋白的色差分析結果

2.10 不同反膠束體系制備的花生蛋白的掃描電鏡照片(SEM)結果

不同反膠束體系制備的花生蛋白樣品的掃描電境照片如圖7所示。通過掃描電鏡照片可以看出，4種花生蛋白從微觀結構上有些差異。堿溶酸沉法提取的花生蛋白主要呈片狀，也有球狀結構，而不同反膠束體系、不同萃取工藝所制備的花生蛋白結構均不相同，這可能與反膠束溶液的pH值，W0，離子強度以及表面活性劑所帶的電荷種類有關。如在反膠束溶液的pH值條件下，反膠束與蛋白質之間產生親水、疏水作用，而使部分蛋白結構發生變化，導致蛋白質粒度減??；W0的大小也影響這反膠束萃取蛋白質分子質量的大小，蛋白質分子質量大，蛋白質的體積就大，在傳遞增溶過程中產生的障礙也越大，因此反膠束所萃取的蛋白質粒度也較小?？傊芯空f明了反膠束特殊的微環境條件下，表面活性劑所帶的電荷與蛋白質分子所帶的電荷產生靜電作用，蛋白質分子所帶的電荷產生靜電作用，離子強度與蛋白質之間產生靜電作用，表面活性劑在有機相中所形成的反膠束數目及大小等都會使蛋白質結構發生改變，如有序結構α－螺旋，β－折疊及β－轉角結構的減少，無序結構的增加，以及氨基酸的分解等變化，從而導致反膠束相制備的蛋白粒度較堿溶酸沉法制備的蛋白小，從而溶解度就較好。進一步說明了反膠束制備的花生蛋白較堿溶酸沉制備的好。

圖7 不同PPI樣品的掃描電鏡顯微照片

3 結論

3.1 在單因素試驗的基礎上進行了驗證試驗，得到了3種反膠束體系后萃花生蛋白的最佳工藝條件。AOT反膠束體系后萃取花生蛋白的最佳工藝條件為:緩沖溶液pH值8.5、萃取時間40 min、萃取溫度40℃、超聲功率240 W、KCl濃度1.5 mol/L，此時蛋白后萃率為83.17%；SDS反膠束體系后萃取花生蛋白的最佳工藝條件為:緩沖溶液pH值9、萃取時間40 min、萃取溫度45℃、超聲功率270 W、KCl濃度1.5 mol/L，此時蛋白后萃率為82.62%；DTAC反膠束體系后萃取花生蛋白的最佳工藝條件為:緩沖溶液pH值9、萃取時間20 min、萃取溫度30℃、超聲功率270 W、KCl濃度 1.5 mol/L，此時蛋白后萃率為73.18%。結果表明，AOT反膠束體系后萃取花生蛋白的萃取率最大。

3.2 通過對不同反膠束體系制備的花生蛋白的色差進行分析，并與堿溶酸沉法制備的花生蛋白相比較，發現不同花生蛋白樣品的L、a、b值都存在顯著性差異。得出AOT反膠束體系制備的花生蛋白色澤是最好的，而堿溶酸沉法制備的花生蛋白的色澤較差。

3.3 掃描電鏡照片的結果顯示，堿溶酸沉法制備的花生蛋白的微觀結構主要呈片狀，部分呈球狀，而反膠束體系制備的花生蛋白，粒度都明顯減小。

3.4 最適合萃取花生蛋白的反膠束體系是AOT反膠束體系。

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