水產飼料用寡肽豆粕制備工藝的研究

宋永康 黃 薇 姚清華 林香信 林 虬

(福建省農業科學院中心實驗室福建省精密儀器農業測試重點實驗室，福州 350003)

水產動物不同于畜禽等單胃動物和反芻動物，其對營養物質的需求、攝取、消化與吸收等方面都有其特性。以鰻鱺為例，其飼料不僅要求具有良好的誘食性、營養性，還需要具有良好黏彈性即蛋白原料與α－淀粉的親和性[1]。近年來水產養殖業發展迅猛，水產飼料蛋白源匱乏日趨嚴重，尋找和開發新的飼料蛋白源已成當務之急。隨著寡肽吸收理論的提出及其生理功能特性認識的加深，運用酶解技術提高植物蛋白品質使其替代魚粉等動物源性蛋白已成為當前研究的熱點[2－3]。大量研究表明，豆粕經酶解制備的大豆多肽具有眾多有利于動物生長的功能和特性，應用在飼料中不僅能夠降低成本，并且可以提高動物的生產性能以及免疫力[4－6]。Rerat等[7]的研究顯示，小肽吸收是逆濃度梯度轉運過程，與游離氨基酸相比，具有耗能低、不易飽和、吸收速度快等特點。

目前，國內外對豆粕酶解研究主要集中在抗營養因子的去除或鈍化、蛋白質的改性以及酶解產物的生物學功能性上，追求高水解度，對酶解產物的加工性能關注較少[8－12]。肽蛋白的營養特性和加工性能與其水解方式和水解程度有密切的相關性，因此必須對水解過程進行嚴格控制[13]。以水解度(DH)為指標，易引起過度水解，導致部分寡肽被徹底水解成游離氨基酸，影響水解產物的加工性能；以酸溶蛋白(或TCA－N)為指標，其結果是反映分子質量小于10 ku的可溶性肽[14]，易造成水解不足，導致飼料的消化率降低；水解不足或過度均不能達到理想效果。本研究首次提出以寡肽得率(分子質量≤2 ku)為指標，同時與水解度進行比較，優化 Alcalase和 Flavourzyme雙酶同步水解制備寡肽豆粕的工藝，并對兩種指標制備的產品進行加工質量指標分析評價，旨在探討豆粕水解進程對水產飼料加工性能的影響，為促進豆粕在水產特種養殖業上的有效利用以及提高豆粕產品質量提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆粕(粗蛋白含量46.12%):福州科匯生物技術有限公司；Alcalase(活力 380 000 U/mL)、Flavourzyme(活力 430 000 U/mL):丹麥 Novozymes公司；十二烷基磺酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT):合肥新恩源生物技術公司；對苯二甲醛(OPA)、單寧酸、甲醛、氫氧化鈉、鹽酸等試劑:國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要設備

Kjeltec 2300自動定氮儀:瑞典Foss有限公司；HJ－3恒溫磁力攪拌器、3HA－C恒溫振蕩器:常州國華電器有限公司；TD5A－WS離心機:長沙湘儀離心機儀器有限公司；AL204電子分析天平:梅特勒－托利多(上海)有限公司；PHS－3C pH酸度計:上海精密科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 水解度的測定

水解度(DH，Degree of Hydrolysis)的定義是指蛋白質水解過程中，被斷裂的肽鍵數h(mmol/g蛋白質)與給定蛋白質的總肽鍵數htot(mmol/g蛋白質)之比。水解度的測定方法采用鄰苯二甲醛(OPA)法[15]，其計算公式為:DH＝h/htot×100%。

1.3.2 寡肽得率的測定

寡肽含量采用單寧酸沉淀法并參考 DB35/T 1089—2011進行測定，通過凱氏定氮法測定經16%單寧酸沉淀后濾液中的寡肽與游離氨基酸總含量，再用甲醛滴定法測定濾液中游離氨基酸的含量，計算兩者的差值即為寡肽的含量。其計算公式為:寡肽得率＝(單寧酸溶蛋白含量－游離氨基酸含量)/總蛋白×100%。

1.3.3 黏彈性評價

黏彈性參照SC/T 1047—2001中規定的方法測定，稱取經粉碎(通過80目)寡肽豆粕38 g與12 g的α－淀粉混均，加入55 mL蒸餾水，在(25±2)℃下，拌和均勻，拉伸20次。

1.3.4 溶失率的測定

參照SC/T 1047—2001中規定的方法測定溶失率。按照1.3.3方法處理兩組樣品，取一組放置靜水中，在水溫(25±2)℃下浸泡1 h，撈出后與另一組對照樣品同時放入烘箱中，105℃恒溫烘至恒重，冷卻后分別準確稱重。其計算公式為:溶失率＝(對照料烘干質量－浸泡料烘干質量)/對照料烘干質量×100%。

1.3.5 工藝路線

稱取粉碎豆粕置于反應杯中，按一定比例加水勻漿，放置90℃水浴鍋中浸提15 min，用氫氧化鈉或者鹽酸調節體系pH至酶的最適pH，加入一定量的蛋白酶，在適當溫度下恒溫酶解，反應結束后，取出樣品溶液置于沸水浴中滅酶15 min，5 000 r/min離心10 min，所得上清液測定寡肽得率、DH后進行烘干、粉碎，所得樣品即為寡肽豆粕，取適量用于黏彈性評價和溶失率測定。

1.3.6 正交試驗設計

根據單因素試驗結果，固定酶活力比(Alcalase:Flavourzyme)為 2∶1，考慮底物濃度、加酶量、反應pH、反應溫度以及酶解時間等因素對豆粕寡肽得率的影響，選擇5因素4水平進行L16(45)正交試驗，優化各因素組合。正交試驗因素和水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平

1.4 數據處理

正交試驗結果采用SAS9.0進行極差和方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶解時間對寡肽得率和DH的影響

在底物濃度10%、酶濃度2 000 U/g、Alcalase與Flavourzyme酶活力比1∶1、pH 8.0、溫度50℃的條件下，測定不同的酶解時間對豆粕寡肽得率和DH的影響(圖1)。在0～8 h的酶解過程中，體系DH和寡肽得率均不斷增加；當水解時間達到8 h時，寡肽得率達到最大；8 h后DH繼續升高而寡肽得率降低。這可能是Flavourzyme包含有內切肽酶和外切肽酶兩種活性，不僅作用于肽鏈內部的肽鍵，而且作用于肽鏈外部的肽鍵，較長的酶解時間導致了部分寡肽被徹底水解成游離氨基酸。因此，確定適宜的酶解時間為8 h。

圖1 酶解時間對寡肽得率和DH的影響

2.1.2 底物濃度對寡肽得率和DH的影響

在酶濃度2 000 U/g、Alcalase與 Flavourzyme酶活力比1∶1、pH 8.0、溫度50℃的條件下酶解8 h，測定不同底物濃度酶解后的豆粕寡肽得率和DH(圖2)。隨著底物濃度的增加，水解度和寡肽得率逐漸降低；當底物濃度大于10%時，水解液離心分離后溶液渾濁不清。這是由于底物濃度過高，體系流動性較差，不利于蛋白質的充分溶解和分散，酶與底物的接觸機會也逐漸降低。底物濃度不僅影響DH和寡肽得率，而且直接決定生產成本，生產中應盡量提高底物濃度。綜合考慮生產成本和酶解效率，確定底物適宜濃度為10%。

圖2 底物濃度對寡肽得率和DH的影響

2.1.3 pH對寡肽得率和DH的影響

在底物濃度10%、酶濃度2 000 U/g、Alcalase與Flavourzyme酶活力比1∶1、溫度50℃、酶解時間8 h的條件下，測定不同pH值對豆粕寡肽得率和DH的影響(圖3)。pH值在6.0～10.0的范圍內，寡肽得率和DH的變化呈相似趨勢，均為先增大之后再減小，在pH 8.0時達到最高。酶的催化能力與pH密切相關，環境pH值能夠影響酶分子的構象和酶與底物的解離狀態，從而影響酶的催化反應速率和酶與底物的結合，過高或過低均對酶促反應不利。因此選定8.0作為水解的最適pH。

圖3 pH對寡肽得率和DH的影響

2.1.4 溫度對寡肽得率和DH的影響

在底物濃度10%、酶濃度2 000 U/g、Alcalase與Flavourzyme酶活力比 1∶1、pH 8.0、酶解時間 8 h的條件下，測定不同溫度對豆粕寡肽得率和DH的影響(圖4)。當反應溫度較低(45～55)℃時，體系寡肽得率和DH隨溫度升高而逐漸上升，并于55℃時達到最大值；相反地，當反應溫度較高(55～65)℃時，則體系寡肽得率和DH隨溫度升高而逐漸下降。在溫度較低時，溫度升高能加劇蛋白質分子的擴散使得酶促反應加快，但過高的溫度易引起維持酶分子結構次級鍵解體，導致酶失活速率加快。故確定最適反應溫度為55℃。

圖4 反應溫度對寡肽得率和DH的影響

2.1.5 酶活力比對寡肽得率和DH的影響

在底物濃度 10%、酶濃度2 000 U/g、pH 8.0、溫度55℃、酶解時間8 h的條件下，測定Alcalase與Flavourzyme酶活力比對豆粕寡肽得率和DH的影響(圖5)。結果表明，酶活力比對豆粕寡肽得率影響不明顯。當 Alcalase與 Flavourzyme酶活力比為2∶1時，體系寡肽得率和DH最大。因此，后續的雙酶同步水解試驗，選取Alcalase酶與Flavourzyme酶活力比為 2∶1。

圖5 酶活力比對寡肽得率和DH的影響

2.1.6 加酶量對寡肽得率和DH的影響

在底物濃度10%、Alcalase與Flavourzyme酶活力比為2∶1、pH 8.0、溫度55℃、酶解時間8 h的條件下，測定不同加酶量對豆粕寡肽得率和DH的影響，結果見圖6。結果表明，加酶量在400～3 200 U/g范圍內，寡肽得率與DH隨加酶量的增加而快速上升，當加酶量達到3 200 U/g時，再進一步增加酶用量，寡肽得率與DH增幅不明顯，此時酶分子與底物分子接觸飽和，轉化效率達到最大，因而寡肽得率基本不再變化。綜合考慮酶解反應過程，選用加酶量3200 U/g較為適宜。

圖6 加酶量對寡肽得率和DH的影響

2.2 正交試驗

L16(45)正交組合試驗結果與分析見表2和表3。由表2極差R可知，影響豆粕寡肽得率大小順序為:A＞B＞D＞C＞E，而影響豆粕DH的各因素主次順序為:C＞D＞A＞B＞E，這說明各因數對豆粕寡肽得率和DH的影響次序有差異。方差分析結果表明(表3):寡肽得率模型的P值小于0.01，復相關系數R2＝0.978，校正決定系數AdjR2＝0.958，表明寡肽得率模型為滿意模型，除酶解時間影響顯著外，其他因素對寡肽得率的影響均極顯著(P＜0.01)；DH模型的P值小于0.01，同樣表明該模型為滿意模型，各因素對DH的影響極顯著(P＜0.01)。

在所選因素水平下，寡肽得率的最佳組合為A1B2C3D4E2，即底物濃度 8%、加酶量 3000U/g、pH 8.0、溫度61℃、酶解時間7.5h。在該組合條件下，豆粕寡肽得率為38.16%，DH為22.69%。而在DH的最優組合A1B3C4D3E2，即底物濃度8%、加酶量3200U/g、反應 pH8.5、反應溫度 58℃、酶解時間7.5h。在該組合條件下，DH升至26.93%，寡肽得率降為32.21%，因此選用不同的參數指標對水解的產物關系密切。

表2 正交試驗設計及結果

表3 方差分析表

2.3 寡肽豆粕的加工質量指標

在寡肽得率最佳組合A1B2C3D4E2和DH最優組合A1B3C4D3E2條件下水解豆粕，產物經烘干、粉碎，制成兩種寡肽豆粕產品，對其黏彈性進行評價并測定溶失率。DH最優組合的產品黏彈性和伸展性欠佳，展開成薄狀有裂痕，按凹后不能完全反彈復原且會黏手，溶失率高達(6.8±0.9)%，超過 SC/T 1077—2004漁用配合飼料粉料溶失率≤5%的要求。寡肽得率最佳組合的產品具有良好的黏彈性和伸展性，經拉伸后體積明顯膨脹，能承受壓力，展開成薄狀均勻有序，按凹后很快反彈復原且不黏手，溶失率僅為(2.5±0.7)%，表明該產品與α－淀粉具有較佳的親和性，能夠滿足特種水產飼料加工質量指標要求。

3 結論

3.1 選用Alcalase和Flavourzyme對豆粕進行同步酶解，體系寡肽得率與加酶量、反應pH及反應溫度顯著相關，體系DH與加酶量、反應pH、反應溫度及酶解時間顯著相關，寡肽得率模型和DH模型均為滿意模型。

3.2 確定Alcalase與Flavourzyme同步酶解制備寡肽豆粕的最佳工藝條件為:酶活比(Alcalase:Flavourzyme)2∶1、加酶量 3 000 U/g、底物濃度 8%、反應pH 8.0、反應溫度61℃、酶解時間7.5 h。在此條件下水解豆粕，DH為22.69%，寡肽得率可達38.16%。

3.3 建立了以寡肽得率為控制參數的雙酶同步法制備寡肽豆粕的工藝條件，解決了蛋白酶解過程中水解不足或過度問題。制備的寡肽豆粕粉與α－淀粉具有較好的親和性，散失率僅為(2.5±0.7)%，質量指標能達到特種水產飼料加工要求。

參考文獻

[1]吳銳全，肖學錚，黃樟翰，等.鰻鱺的營養需求與飼料配制[J].飼料研究，1999，7:1－3

[2]胡世榮，陳志強，劉佳銘，等.酶解法制備大豆多肽的工藝研究[J].食品科學，2008，29(10):187－190

[3]李善仁，陳濟琛，胡開輝，等.大豆肽的研究進展[J].中國糧油學報，2009，24(7):142－147

[4]陳路，張日俊.生物活性肽(或寡肽)飼料添加劑的研究與應用[J].動物營養學報，2004，16(2):12－14

[5]Ai Q H，Xie X J.Effects of dietary soybean protein levels on energy budget of the southern catfish，Silurus meridionalis[J].Comparative Biochemistry and Physiology，2005，141:461－469

[6]俞曉輝，姚文，施學仕，等.大豆發酵蛋白替代魚粉對斷奶仔豬生產性能和腸道主要菌群的影響[J].動物營養學報，2008，20(1):46－51

[7]Rerat A，Nunes C S，Mendy F，et al.Amino acid absorption and production of pancreatic hormones in non－anaestheetized pigs after duodenal infusions of a milk enzymic hydrolysate or of free amino acid[J].British Journal of Nutrition，1988，60(1):121－136

[8]劉海燕，邱玉朗，魏炳棟，等.微生物發酵豆粕研究進展[J].動物營養學報，2012，24(1):35－40

[9]張智宇，朱秀清，任為聰，等.擠壓膨化對胰蛋白酶酶解高變性豆粕效果的影響[J].中國糧油學報，2011，26(3):20－24

[10]陳京華，麥康森.不同添加方式植酸酶處理豆粕對牙鲆生長和飼料利用率的影響[J].水生生物學報，2010，34(3):482－487

[11]Kim N Y，Song E J，Kwon D Y，et a1.Antioxidant and antigenotoxic activities of Korean fermented soybean[J].Food and Chemistry Toxicology，2008，46(3):1184－1189

[12]Hubert J，Berger M，Nepveu F，et a1.Effects of fermentation on the phytochemical composition and antioxidant properties of soy germ[J].Food Chemistry，2008，109:709－721

[13]Adler－Nissen J.Determination of the degree of hydrolysis of food protein hydrolysates by trinitrobenzenesulfonic acid[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1979，27(6):1256－1262

[14]Antoine M，Erwin F，Albert R.Continuous monitoring of enzymatic whey protein hydrolysis.correlation of base consumption with soluble nitrogen content[J].Process Biochemistry，1994，29:257－262

[15]Nielsen P M，Petersen D，Dambmann C.Improved method for determining food protein degree of hydrolysis[J].Journal of Food Science，2001，66(5):642－646.