布魯菌致病特點(diǎn)和疫苗的研究新進(jìn)展

白旭華，呂昌龍

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，內(nèi)蒙古通遼 028000;2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)免疫研究所，遼寧沈陽(yáng) 110001)

布魯菌病(Brucellosis)簡(jiǎn)稱布病，是由布魯菌(Brucella)引起的一種人畜共患的傳染性疾病。布魯菌是一種革蘭陰性菌，有粗糙型和光滑型2種，能夠在細(xì)胞內(nèi)寄生，感染家畜引起流產(chǎn)和不孕，造成大量的經(jīng)濟(jì)損失，還能引起人的波狀熱、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎和骨髓炎等［1］。布魯菌屬細(xì)菌大多數(shù)種型對(duì)人畜是有致病性的，對(duì)人畜皆有致病作用的是羊種菌(B.melitensis)、牛種菌(B.abortus)、豬種菌(B.suis)和犬種菌(B.canis)，對(duì)畜有致病對(duì)人無(wú)致病的有綿羊附睪種(B.ovis)，對(duì)人畜皆無(wú)致病的是林鼠布魯菌(B.neotomae)。布魯菌抗原的主要成分是脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和高度特異的外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)。LPS包含3種成分:O多糖抗原、核心多糖和類脂A。光滑型較粗糙型多含O鏈脂多糖。布魯菌致病毒力因子是LPS、OMP及其他毒力相關(guān)因子。毒力相關(guān)因子包括過(guò)氧化氫酶、尿素酶、cu/zn超氧岐化酶、RecA重組調(diào)節(jié)基因、groE生長(zhǎng)基因、HtrA耐高溫基因和ErY基因等。

1 布魯菌致病特點(diǎn)及其機(jī)制

布魯菌感染宿主細(xì)胞后，宿主細(xì)胞通過(guò)模式識(shí)別受體(pattern recognize receptor，PRR)識(shí)別病原體的某些高度保守分子結(jié)構(gòu)，即病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecule pattern)，激活固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。已經(jīng)證明的PRR有Toll樣受體(TLRs)、核苷酸結(jié)合寡聚化作用域樣受體(nucleotide binding and oligomerization domain-like receptors)和視黃酸誘導(dǎo)基因1-樣受體(retinoic acid-inducible gene 1-like receptors)。在抗布魯菌的適應(yīng)性免疫中有2種機(jī)制發(fā)揮重要作用，一是CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和γδ T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ激活巨噬細(xì)胞，抑制布魯菌在吞噬細(xì)胞內(nèi)的生存復(fù)制;二是CD8+T細(xì)胞和γδ T細(xì)胞致布魯菌感染的靶細(xì)胞裂解破壞。布魯菌最突出的致病特點(diǎn)是干擾宿主細(xì)胞發(fā)揮固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。布魯菌通過(guò)減少、修飾或隱藏病原相關(guān)分子模式(如LPS)的方式，經(jīng)由脂筏進(jìn)入巨噬細(xì)胞吞噬體后，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)融合，獲得部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜形成含布魯菌空泡(Brucella-containing vacuole，BCV)，實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)生存復(fù)制，從而逃避適應(yīng)性免疫應(yīng)答的激活和產(chǎn)生［2］。

1.1 布魯菌的非典型LPS結(jié)構(gòu)

布魯菌表面缺乏能激活固有免疫應(yīng)答的結(jié)構(gòu)，如莢膜、菌毛和纖毛等。布魯菌的顯著特點(diǎn)是含有非典型的LPS結(jié)構(gòu)。與其他革蘭陰性菌相比，布魯菌的類脂A含有雙氨基葡糖骨架，而不是葡糖胺和酰基結(jié)構(gòu)。此種類脂A易誘發(fā)的是弱而且持續(xù)性的炎性應(yīng)答［3］。LPS的O抗原可降低巨噬細(xì)胞的活性，致使布魯菌不能被有效殺傷;O抗原還能與MHCⅡ類分子結(jié)合成復(fù)合物，抑制巨噬細(xì)胞對(duì)布魯菌蛋白質(zhì)抗原的提呈，也就不能為T細(xì)胞的激活提供信號(hào)。Barrionuevo等［4］研究證實(shí)熱滅活的布魯菌或脂蛋白能夠下調(diào)抗原提呈細(xì)胞表達(dá)MHCⅡ分子，這個(gè)過(guò)程具有TLR-2依賴性，并且由IL-6介導(dǎo)。

1.2 布魯菌在布氏小體內(nèi)大量復(fù)制

布魯菌LPS以外的其它因素也可使細(xì)菌進(jìn)入吞噬細(xì)胞，不能激活有效的抗菌機(jī)制。布魯菌通過(guò)脂筏進(jìn)入巨噬細(xì)胞形成的BCV，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum)膜融合，形成布魯菌在吞噬細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制部位;不與溶酶體融合，逃避細(xì)菌被溶酶體酶降解［5］。此過(guò)程依賴于Ⅳ型分泌系統(tǒng)(typeⅣ secretion system)分泌的分子 VirB。VirB在宿主細(xì)胞內(nèi)可改變布魯菌的運(yùn)送途徑，使細(xì)菌輸送到增殖部位。此外，布魯菌還能夠產(chǎn)生周質(zhì)環(huán)狀 β-1，2-葡聚糖(periplasmic cyclic β-1，2-glucan)，與巨噬細(xì)胞內(nèi)的膽固醇形成脂筏，誘導(dǎo)運(yùn)送布魯菌至BCV。

1.3 布魯菌的Btp1/TcpB蛋白抑制激活免疫應(yīng)答

Btp1/TcpB蛋白可通過(guò)抑制TLRs介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活信號(hào)通路，導(dǎo)致布魯菌的體內(nèi)持續(xù)性存活與感染。Sengupta等［6］研究證明布魯菌Btp1/TcpB蛋白與TLRs中的TIR結(jié)構(gòu)域具有顯著同源性。細(xì)胞內(nèi)的MyD88、MAL/TIRAP、TRIF和TRAM等適配器分子也同樣含有TIR結(jié)構(gòu)域。Btp1/TcpB蛋白與MAL/TIRAP結(jié)合，通過(guò)MyD88依賴途徑干擾TLR2介導(dǎo)的信號(hào)通路，阻止布魯菌感染的樹(shù)突狀細(xì)胞成熟。Btp1/TcpB蛋白還能夠?qū)е翸AL的多泛素化作用增強(qiáng)，加速M(fèi)AL的降解過(guò)程。深入了解布魯菌抑制機(jī)體免疫應(yīng)答激活的機(jī)制將有助于有效疫苗的研制。

2 布魯菌新型疫苗的研究進(jìn)展

2.1 減毒活疫苗

目前，牛種布魯菌株19(B.abortus strain 19，S19)、羊種布魯菌株 Rev.1(B.melitensis Rev1，Rev1)和粗糙型牛種布魯菌株51(rough strain B.abortus 51，RB51)3種減毒活疫苗廣泛用于家畜的布魯菌感染預(yù)防，并已取得一定的成效。但S19和Rev1減毒活疫苗仍具有較高毒力，會(huì)導(dǎo)致懷孕家畜流產(chǎn)，對(duì)人也具有一定的致病性。此外，S19和Rev1菌株的LPS還會(huì)干擾布魯菌病的臨床實(shí)驗(yàn)診斷。

為克服目前減毒活疫苗存在的缺點(diǎn)，將減輕疫苗毒力和誘導(dǎo)LPS合成相關(guān)基因突變作為疫苗的有效研究策略。Barrio等［7］觀察了用3種核心和O-多糖缺陷B.melitensis突變株wbkF、per和wa＊＊制備的疫苗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在小鼠模型中獲得了非常理想的保護(hù)性效果，但接種羊后其保護(hù)率僅為54%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Rev1疫苗的100%有效率。進(jìn)一步證明減毒活疫苗刺激機(jī)體主要產(chǎn)生抗O-多糖抗體。Lacerda等［8］發(fā)現(xiàn)阻止wbkC基因轉(zhuǎn)錄，可產(chǎn)生牛型布魯菌(B.Abortus)粗糙型突變。wbkC基因編碼LPS合成相關(guān)甲基化轉(zhuǎn)移酶。用該牛型布魯菌△wbkC突變株感染骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與光滑型比較粗糙型不形成復(fù)制龕，能誘導(dǎo)高水平的 IL-12和 TNF-α的產(chǎn)生。在C57BL/6和干擾素調(diào)節(jié)因子-1(IRF-1)敲出鼠體內(nèi)均顯示弱毒性。

Arenas-Gamboad等［9］將S19的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子VjbR基因敲出制成突變株，接種小鼠模型發(fā)現(xiàn)其編碼相關(guān)產(chǎn)物virB操縱子和鞭毛基因的表達(dá)下調(diào)，毒力下降，誘導(dǎo)了高水平抗布魯菌感染的保護(hù)力。Trant等［10］構(gòu)建了磷酸甘油酸激酶(PGK)基因敲出B.abortus突變株，該突變株在骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞和BALB/c、C57BL/6、129/Sv和 IRF-1敲出鼠體內(nèi)均顯示了極低毒性。感染24 h后未發(fā)現(xiàn)野毒株感染后形成的含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的復(fù)制龕。60%以上的BCVs檢出內(nèi)體/溶酶體的標(biāo)記LAMP1。將此突變株制成活疫苗，接種129/Sv和IRF-1敲出小鼠進(jìn)行攻擊實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示了遠(yuǎn)超出S19和RB51減毒疫苗株的免疫保護(hù)強(qiáng)度。

上述研究提示對(duì)布魯菌某些毒力基因進(jìn)行修飾可能會(huì)為疫苗的制備帶來(lái)希望。

2.2 重組蛋白疫苗

重組蛋白疫苗是亞單位疫苗中的一種。布魯菌細(xì)胞表面和胞內(nèi)的許多蛋白組分已作為保護(hù)性抗原進(jìn)行研究，如Omp31、L7/L12核糖體蛋白、2，4-二氫喋啶合酶(The lumazine synthase)等。Yang等［11］應(yīng)用基因重組技術(shù)制備的S-腺苷高半胱氨酸水解酶(AdoHcyase)接種動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)此重組蛋白疫苗能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)的Th1型免疫應(yīng)答，保護(hù)效果與Rev1減毒活疫苗相似。周質(zhì)結(jié)合蛋白39(periplasmic-binding protein 39，P39)與CpG寡核苷酸結(jié)合形成重組蛋白疫苗免疫小鼠4周后的保護(hù)作用，與減毒活疫苗S19免疫8周后的效果相似，提示重組蛋白疫苗具有巨大潛力。

與減毒活疫苗相比，重組蛋白疫苗具有安全性高、無(wú)傳染風(fēng)險(xiǎn)、不會(huì)轉(zhuǎn)變成致病株等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是免疫原性相對(duì)較弱，因此需要具有免疫調(diào)節(jié)作用的佐劑輔助［12］。Denisov 等［13］比較了 larifan、polyoxidonium、natrium thiosulfate、TNF-β 等佐劑的效果，發(fā)現(xiàn) TNF-β作為B.abortus株82-PS佐劑的免疫作用最強(qiáng)。Kaushik等［14］將保護(hù)性抗原Omp39與佐劑CpG寡核苷酸序列結(jié)合，研制的rOmp39重組蛋白疫苗，接種于小鼠模型顯示有中等水平的抗B.abortus作用。

到目前為止雖已報(bào)道了 L7/L12、BLS、OMP31、P39、DNAK、SurA、Omp28、CGH、Omp16、Omp19和S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶等多種重組蛋白疫苗具有一定的免疫保護(hù)作用，但聯(lián)合多種抗原蛋白的疫苗并未顯示其優(yōu)越性。其原因可能是不同抗原表位間存在相互干擾［15］。有關(guān)Cu-Zn超氧化物歧化酶(Cu-Zn superoxide dismutase，Cu-Zn SOD)重組蛋白疫苗的研究發(fā)現(xiàn)，真正具有保護(hù)作用的不是Cu-Zn SOD的全部，而是其中的一條肽鏈。因此，研制重組蛋白疫苗中選擇合適的抗原肽進(jìn)行重組是其關(guān)鍵步驟。此外，Pasquevich等［16-17］首次提出重組蛋白疫苗Omp16和Omp19中的脂蛋白本身具有佐劑的特性，從而避免添加外源性佐劑可能造成的不良反應(yīng)(如注射部位炎性肉芽腫和無(wú)菌膿腫的形成)。為重組蛋白疫苗的研制開(kāi)辟了另一種思路。

2.3 DNA 疫苗

DNA疫苗指直接把含有目的抗原基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或注射到動(dòng)物細(xì)胞中，使之在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)出天然的抗原物質(zhì)，誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytolytic T cell，CTL)及Th1型免疫應(yīng)答。布魯菌的全基因組測(cè)序的完成為研制DNA疫苗提供了完整的抗原基因信息。在布魯菌感染的小鼠模型中，許多抗原基因已經(jīng)被作為DNA疫苗進(jìn)行研制，如外膜蛋白、細(xì)菌表面蛋白、核蛋白的基因。

已有的研究顯示，含有單一目的基因的DNA疫苗雖具有一定的免疫保護(hù)效果，但并不十分理想。應(yīng)用可表達(dá)多種抗原的多價(jià)DNA疫苗接種小鼠，發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生更高強(qiáng)度的免疫保護(hù)作用，認(rèn)為其機(jī)制可能是多種抗原誘導(dǎo)了IFN-γ分泌、特異性Th1型抗體產(chǎn)生和CD8+CTL活化等不同種類免疫應(yīng)答的協(xié)同作用［18］。Luo等［19］研制的含有L7/L12和Omp16基因的DNA疫苗，證實(shí)較含單一基因的DNA疫苗的效果有顯著提高，其提高與CD8+CTL活性增強(qiáng)有關(guān)。將編碼細(xì)胞因子的基因與編碼可刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的布魯菌抗原分子的基因重組制備DNA疫苗，能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈免疫應(yīng)答。疫苗接種后表達(dá)的細(xì)胞因子可作為佐劑發(fā)揮效應(yīng)。還可通過(guò)改變抗原基因的啟動(dòng)子或插入分泌信號(hào)序列的方式，使抗原基因更有效表達(dá)，提高DNA疫苗的免疫原性和免疫應(yīng)答刺激作用。

針對(duì)DNA疫苗肌肉接種需要較大劑量DNA疫苗的問(wèn)題，有人提出應(yīng)用基因槍接種或納米顆粒技術(shù)解決，以便提高DNA疫苗的攝入率和體內(nèi)存留半衰期延長(zhǎng)［20］。已有的研究報(bào)道，小鼠模型研究獲得有效的布魯菌DNA疫苗接種于較大動(dòng)物并非全部獲得與小鼠同樣的結(jié)果，提示相關(guān)DNA疫苗的研制尚需進(jìn)一步改進(jìn)［21］。DNA疫苗的生物安全性問(wèn)題，如誘導(dǎo)免疫耐受和自身免疫疾病的產(chǎn)生、基因的穩(wěn)定性、抗性基因的轉(zhuǎn)移等仍需考慮和進(jìn)行全面評(píng)價(jià)。

3 結(jié)語(yǔ)

布魯菌具有非典型的LPS結(jié)構(gòu)，可通過(guò)脂筏進(jìn)入巨噬細(xì)胞形成布氏小體，實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)生存和復(fù)制，導(dǎo)致機(jī)體的持續(xù)性感染。布魯菌感染、致病、逃避和抑制機(jī)體免疫應(yīng)答的機(jī)制，應(yīng)作為設(shè)計(jì)具有特異性保護(hù)力的DNA疫苗、重組蛋白疫苗和減毒活疫苗的依據(jù)。針對(duì)布魯菌的PRR(如TLRs)研制其激動(dòng)劑作為佐劑，會(huì)有效活化抗原提呈細(xì)胞提呈抗原，減弱免疫耐受性，刺激機(jī)體固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答［22］。此外，納米微粒技術(shù)研制疫苗的引入，還可能保護(hù)所承載的抗原免受各種酶的降解，延長(zhǎng)免疫應(yīng)答的時(shí)間，增強(qiáng)抗原達(dá)到黏膜相關(guān)淋巴組織的效率，誘導(dǎo)記憶細(xì)胞的產(chǎn)生，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)生持久保護(hù)性免疫的目標(biāo)［23］。

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