利用微生物制劑提高梗絲品質的研究

陳興，申曉峰，鞏效偉，陳微，黨立志，段焰青

紅云紅河煙草（集團）有限責任公司技術中心，昆明 650202

隨著我國卷煙工藝加工技術水平的提高和煙草行業減害降焦工作的持續開展，梗絲在卷煙配方中的應用更加廣泛。在配方中加入梗絲后，由于其填充值較高，可以減少卷煙煙絲用量，不僅節約卷煙成本，也可以起到降低卷煙焦油量的作用[1-2]。然而，由于煙梗的主要成分是細胞壁物質，包括大量的木質素、纖維素、半纖維素和果膠，其熱裂解產物具有較強的刺激性和雜氣，且香氣貧乏，吃味平淡，嚴重影響卷煙的吸味品質[3-4]，致使梗絲在卷煙配方中的摻兌比例一般不大，造成大量煙梗被廢棄。

微生物生長過程中，能夠通過直接或間接利用某些木質素、纖維素、蛋白質和微量元素等營養源，分解代謝合成出不同種類的生物酶，能夠有效促進煙葉中大分子化合物之間的分解和轉化，促進致香成分的產生和積累并降低有害成分的含量，從而提高煙葉的抽吸品質[5-8]。利用微生物技術提高煙葉的香氣和品質方面已有較多的研究。黃靜文等[9]將從烤煙葉面上分離到的短小芽孢桿菌用于煙絲發酵，處理后煙絲的化學成分比例更加協調，處理后的樣品煙香提高、煙氣更為醇和、刺激性和雜氣均有所改善；朱大恒等[10]利用產香菌的發酵產物作為香料來提高煙葉香氣，使卷煙品質明顯改善。然而，利用微生物直接作用于梗絲，提高梗絲抽吸品質的報道尚不多見[11]。本研究利用產香微生物制劑作用于梗絲，旨在探討利用微生物制劑提高梗絲抽吸品質的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 梗絲材料

云南烤煙煙梗，紅云紅河煙草（集團）有限責任公司昆明卷煙廠梗加工車間切絲。

1.1.2 菌種

實驗室保存的短小芽孢桿菌V35菌株（Bacillus pumilusVan35），分離至醇化煙葉表面。該菌株目前已保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 3411。

1.1.3 培養基

LB培養基：蛋白胨 10 g、酵母提取物 5 g、NaCl 10 g，加水至1 L。121℃滅菌20 min，用于菌種培養。

1.1.4 試驗儀器

Skalar SANPWS 流動分析儀（荷蘭Skalar公司）；ABS204-S 電子天平（感量：0.0001 g，瑞士Mettler Toledo公司）；Cyclotec 1093 旋風式樣品磨（瑞典FOSS中國有限公司）；FED可編程熱風循環烘箱（德國Binder公司）；R114旋轉蒸發儀（瑞士BüCHI公司）；6890N/5975N 氣相色譜/質譜聯用儀，使用HP-5MS毛細管色譜柱（美國Agilent 公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的培養和微生物制劑的制備

將菌株V35接種于50 mL的LB液體培養基中，37℃、180 r/min振蕩培養14 h，獲得液體菌種。將液體菌種按0.1 %的接種量接種于200 mL的LB液體培養基中，37℃、180 r/min振蕩培養14 h至OD值為2.0。取培養液20 mL，以8000 r/min離心10 min，去上清。用無菌水洗滌沉淀，離心。最后用200 mL無菌水振蕩均勻，即為微生物制劑。

1.2.2 梗絲的處理

分別取菌劑5 mL，10 mL，20 mL，不足20 mL則用無菌水補足至20 mL，振蕩均勻，即得不同濃度處理液。用小型噴霧器分別將處理液均勻地噴加到100g梗絲上；以噴加無菌水為對照，設置3次重復。將梗絲裝入密封袋，并在袋上扎少量小孔。30℃處理48 h后，將溫度升至120℃保持20 min，使菌在高溫下失活。將梗絲于120℃烘箱中烘干，使水分含量達到11%-13%。

1.2.3 化學成分的測定

按行業標準方法（YC/T159-2002，YC/T160-2002，YC/T161-2002，YC/T 162-2002，YC/T 217-2007）測定樣品中可溶性總糖、還原糖、總煙堿、總氮、氯、鉀的含量。

1.2.4 細胞壁成分的測定

細胞壁成分的測定方法參照張槐苓等[12]。

1.2.5 致香成分的測定

用GC-MS檢測樣品中致香成分的含量。GC-MS分析測試條件：毛細管柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 m）；進樣口溫度：240℃；載氣：He，1 mL/min；程序升溫：初始溫度50℃，保持1 min，以8℃/min升溫到160℃，保持2 min，再以8℃/min升溫到260℃，保持15 min；進樣量：2 μL，分流比：25:1；傳輸線溫度：280℃；電離方式：EI，電離能量：70eV；離子源溫度：230℃；四級桿溫度：160℃；質量范圍35-455 amu。按此分析測試條件，對揮發性成分進行GC-MS分析，所得圖譜經計算機譜庫（NIST98，Wiley275）檢索，并用內標校正歸一化法計算各峰的相對含量。

1.2.6 感官評價

將處理后的梗絲及對照放入恒溫恒濕箱中，在溫度（22±1）℃、相對濕度（60±2）%平衡48 h，手工卷制成卷煙，由評吸專家組成的評吸小組進行感官評吸。

1.2.7 數據處理

用SPSS軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 V35菌劑處理后梗絲化學成分的變化

按10 mL菌劑/100 g梗絲處理48 h后，對梗絲的化學成分進行了檢測并經SPSS軟件進行了方差分析，結果見表1。經菌劑處理后，梗絲的多項化學成分發生了顯著的變化。經V35菌劑處理后，梗絲的總糖和還原糖含量分別較對照上升了10.19 %、10.68 %，達極顯著水平；總氮含量較對照下降了5.70 %，達顯著水平；氯離子、鉀離子及總煙堿變化不明顯。V35菌劑處理后，梗絲的糖氮比和糖堿比分別較對照升高了17.70 %和 8.00 %。

表1 V35菌劑處理對梗絲化學成分含量的影響

2.2 V35菌劑處理對梗絲細胞壁成分的影響

按10 mL菌劑/100 g梗絲處理48 h后，對梗絲的化學成分進行了檢測并經SPSS軟件進行了方差分析，結果見表2。經菌劑處理后，梗絲的纖維素和果膠含量顯著降低，分別較對照下降9.78%、8.06%，總細胞壁物質含量下降6.02%。經SPSS軟件進行方差分析可知，纖維素含量及細胞壁物質總量與對照相比差異達顯著水平，果膠含量與對照達極顯著水平，說明V35處理對于降低煙梗中纖維素、果膠及總細胞壁物質含量效果明顯，而對半纖維素和木質素的含量影響不顯著。

表2 V35菌劑對梗絲細胞壁成分含量的影響

2.3 V35菌劑處理后梗絲致香成分的變化

按10 mL菌劑/100 g梗絲處理48 h后，通過GC-MS對樣品的致香成分的含量和變化進行了檢測。煙葉中主要的香氣物質有類胡蘿卜素降解產物、苯丙氨酸代謝產物、萜烯類化合物、非酶棕色化反應產物幾大類[12]。對V35菌劑處理后的香氣成分進行了分析，結果如表3所示。

類胡蘿卜素是煙葉中重要的香氣前體物，煙葉經調制、醇化后95%的類胡蘿卜素將分解形成不同的香味物質，對煙葉的香氣起著重要的作用[13]。從表3中可以看出，V35菌劑處理后煙梗的類胡蘿卜素降解產物含量較對照有所升高，升高幅度為17.95%。煙草中苯丙氨酸的代謝轉化是影響煙草香味的重要過程之一，其代謝產物如苯甲醇、苯乙醇都是煙草中的重要致香成分，可使煙草增加類似花香的香味[12]。V35菌劑處理后，梗絲的苯甲醛、苯甲醇、苯乙醇和苯乙醛均表現出一定的增加，苯丙氨酸類物質總量較對照也有所增加。V35菌劑處理后新植二烯的含量有所升高，萜烯類物質總量也表現為一定程度的升高。糖類和氨基酸的非酶棕色化反應所生成的雜環產物是煙草香氣的重要來源之一[14]。V35處理后非酶棕色化反應產物較對照有所增加。用V35菌劑對梗絲進行處理后，香氣物質總量增加幅度達到了14.65 %，說明利用微生物菌劑處理有利于增加煙梗總揮發性香氣物質的含量。

表3 V35菌劑處理后梗絲致香成分檢測結果 （μg/g)

2.4 V35菌劑處理后梗絲感官評吸結果

表4 V35菌劑處理對梗絲抽吸品質的影響

對不同濃度V35菌劑處理后的梗絲進行感官評吸，評吸結果見表4。評吸結果表明，經V35處理的梗絲香氣特征表現更為突出，煙氣刺激性有所改善，評吸排序表明適宜的處理濃度為10 mL菌液/100 g梗絲。

3 討論

微生物在生長過程中產生生物酶，生物酶能夠改變反應底物分子的形狀和催化加速底物分子內部某些化學鏈的斷裂，加速底物大分子的降解和某些有害物質的分解，并通過特定微生物的吸收、利用、轉化形成一系列有益小分子化合物[15]。于建軍等[16]利用果膠酶處理煙葉，結果表明果膠酶能夠降低煙葉中果膠含量，而總糖含量則隨之升高，利用果膠酶將煙葉中的果膠轉化為水溶性糖是提高煙葉質量的有效手段之一。V35處理后，梗絲的總糖和還原糖含量升高，而纖維素和果膠含量有所下降，其原因推測是由于V35菌株在生長過程中產生的一系列酶類具有降解纖維素、果膠等大分子物質為水溶性糖類的作用。微生物對梗絲品質的提升作用是多種因素綜合作用的結果，其機理仍需進一步的深入研究。

4 結論

利用微生物菌株V35制成菌劑用于梗絲處理，與對照相比，處理后梗絲纖維素、果膠及細胞壁物質總量有所降低，總糖和還原糖有所上升，總氮含量下降；同時四大類致香成分均有所提升。感官評吸表明，梗絲香氣量有所提升，雜氣和刺激性降低。但該結果是在實驗室條件下取得的，其在實際生產中的應用還有待進一步研究。

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