煙草品種DB101青枯病癥狀發(fā)生前后部分蛋白質(zhì)變化規(guī)律研究

袁清華，謝銳鴻，馬柱文，張振臣，李淑玲，李集勤，陳俊標(biāo)

廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所煙草研究室，廣州市天河區(qū)五山金穎西二街18號(hào) 510640

煙草青枯?。═obacco bacterial wilt ）發(fā)生時(shí)可嚴(yán)重影響煙葉產(chǎn)量，防治措施主要包括抗病育種、合理耕作、藥劑防治和生物防治[1-2]?？共∮N從品種特性入手對(duì)煙草進(jìn)行抗性改良，是一條經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、有效的途徑?？共∮N過程中，育種材料的選擇決定育種工作的成敗。因此了解抗病材料的抗性機(jī)理可為育種材料的選擇提供理論依據(jù)。煙草青枯病抗性鑒定通常用抗病品種Dixie Bright101（DB101）作為抗病對(duì)照[3]。DB101來源于美國[4]，是較早選育的抗青枯病的煙草品種。但對(duì)其進(jìn)行抗性機(jī)理研究的報(bào)道較少見。

作為一種新的研究蛋白質(zhì)差異表達(dá)的技術(shù)，蛋白質(zhì)組學(xué)為研究作物抵抗病原微生物的機(jī)理提供了一條十分重要的途徑。這是由于無論是病原微生物對(duì)宿主的識(shí)別和入侵還是宿主對(duì)病原微生物的識(shí)別與抵抗，這兩個(gè)不同作用路徑中的各個(gè)環(huán)節(jié)，都有不同的蛋白質(zhì)發(fā)揮著不同的作用[5]。同時(shí)，在宿主抵抗病原微生物入侵時(shí)發(fā)生的各種生物學(xué)響應(yīng)機(jī)制也有蛋白質(zhì)的參與[6]。有些具有酶功能的蛋白質(zhì)還參與到抗病過程的各種生理生化過程并發(fā)揮十分重要的作用。蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的結(jié)果，是病原入侵時(shí)表現(xiàn)抗性的直接作用物。通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，尋找抗病材料與病原菌相互作用時(shí)的差異表達(dá)蛋白，能夠從蛋白表達(dá)水平上了解作物的抗病機(jī)理，以及其中蛋白之間的相互作用。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)可以在研究作物的抗病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。

宋浩等[7]進(jìn)行不同煙草青枯病抗性品種的蛋白質(zhì)組學(xué)比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個(gè)不同抗性品種間的蛋白質(zhì)組分不同，26 個(gè)蛋白質(zhì)在 2 個(gè)不同抗性品種中發(fā)生了差異變化，其中在DB101 表達(dá)量上升的有12個(gè)，在紅花大金元表達(dá)量上升的有14 個(gè)。本試驗(yàn)應(yīng)用蛋白質(zhì)膠條鑒定技術(shù),對(duì)DB101在接種后應(yīng)對(duì)青枯病菌入侵時(shí)部分蛋白質(zhì)組分的變化過程進(jìn)行了探索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

植物材料：DB101種子為本研究室保存資源。

病原菌材料：中等致病力的青枯菌(由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉瓊光老師提供)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

本試驗(yàn)分別在田間盆栽和人工氣候箱兩個(gè)不同環(huán)境下進(jìn)行研究，對(duì)兩個(gè)不同環(huán)境下的總蛋白質(zhì)組分以SDS-PAGE指紋圖譜的方式考察其發(fā)病前后的總體變化趨勢。通過比較選擇田間盆栽樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)膠條鑒定。

1.2.1 田間盆栽試驗(yàn)

2011年7月5日播種，9月2日移栽，移栽后一周施肥一次。旺長期接種。于2011年11月1日、2011年11月2日分別取樣，對(duì)應(yīng)編號(hào)為A、B系列樣品。選取3株長勢相近、發(fā)病情況一致的煙株，各摘取1片葉片合并裝入自封袋，磨樣時(shí)每個(gè)自封袋為一個(gè)重復(fù)。

1.2.2 人工氣候箱接種試驗(yàn)

1.2.2.1 培養(yǎng)青枯菌

將凍存的青枯菌菌種劃線活化，挑取單菌落接種于100 m LNA液體培養(yǎng)基中，28℃，100 rpm搖床搖菌24 h，培養(yǎng)至菌液濃度約為3.9×108cfu/mL。

1.2.2.2 青枯病接種試驗(yàn)

2011年10月12日播種，發(fā)芽后適時(shí)間苗，每盆保留一株。2011年12月16日接種。用剪刀插入栽培基質(zhì)使根損傷然后淋下1 mL青枯菌液，2個(gè)重復(fù)。2盆（株）注射清水，作為對(duì)照。2011年12月20日接種處理的煙株均發(fā)病，進(jìn)行拍照，并摘取從底部向上數(shù)第3片葉片作為樣品。將樣品裝入自封袋，-80攝氏度保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2. 3 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳

1.2.3.1 提取蛋白質(zhì)

以上樣品各稱取5 g，剪碎研磨成粉末提取蛋白質(zhì)，方法參照Wang等[8]。

1.2.3.2 蛋白質(zhì)定量

各取前面制備的蛋白粉末約30 mg，溶解于600 uL 1×上樣緩沖液（不含溴酚藍(lán)指示劑），振蕩，置于4℃冰箱溶解過夜。取出離心。取50 uL蛋白質(zhì)溶液、50 uL 1×上樣緩沖液分別定容到2 mL,以稀釋后的上樣緩沖液作為空白測各個(gè)樣品的260 nm和280 nm處吸光值。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式（趙亞華，2005）計(jì)算：蛋白質(zhì)濃度=1.45×A280 - 0.74×A260 (mg/mL)計(jì)算各個(gè)樣品的相對(duì)濃度。根據(jù)相對(duì)濃度調(diào)整上樣量，以達(dá)到各樣品總蛋白量一致。Maker加5 μL。

1.2.3.3 電泳

配制15%濃度的分離膠，5%的濃縮膠。用上樣緩沖液溶解蛋白質(zhì)樣品上樣。70V低電壓濃縮，110V電壓電泳。分離膠、濃縮膠、上樣緩沖液配方參照《蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)組實(shí)驗(yàn)指南》（Richard J.Simpson 主編，何大澄主譯 2006）。上樣緩沖液以DTT（二硫蘇糖醇）代替巰基乙醇。

1.2.4 蛋白質(zhì)膠條鑒定

對(duì)樣品進(jìn)行蛋白液提取和凝膠電泳分離； 對(duì)膠條進(jìn)行識(shí)別、編號(hào)，并切膠；膠內(nèi)酶解，并洗脫，得到肽段混合物；通過LC-MS/MS質(zhì)譜分析，得到原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)。通過實(shí)驗(yàn)串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，與數(shù)據(jù)庫模擬得到的理論質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配，從而得到蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果?；诘鞍阻b定結(jié)果，做GO，COG，Pathway等分析。蛋白質(zhì)鑒定的工具是蛋白質(zhì)搜索鑒定軟件Mascot，軟件版本：Mascot 2.3.02。鑒定選用數(shù)據(jù)庫：茄目Solanales txid4069 43571 sequences。搜索選用的酶為胰蛋白酶。選用的儀器：LTQ-Otbitrap-Velos。膠條鑒定由華大基因公司完成。

1.2.5 儀器設(shè)備

臺(tái)式離心機(jī)3SR+ :Thermo，光密度掃描儀GS-800 :Bio-Rad，Concentrator plus真空離心濃縮儀：Eppendorf，PowerPac Universal電泳儀電源：Bio-Rad，Mini-Protein Tetra System微型垂直電泳系統(tǒng)：Bio-Rad，紫外可見分光光度計(jì)DU 800 ：貝克曼庫爾特。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS電泳比較

SDS電泳結(jié)果（圖1）顯示，田間試驗(yàn)結(jié)果與人工氣候箱試驗(yàn)結(jié)果有一致的變化趨勢，即在抗病過程中，部分蛋白質(zhì)組分發(fā)生消解，在表達(dá)量上產(chǎn)生明顯的變化，尤其在分子量大小約為50～60 kD之間的變化最顯著。

圖1 DB101在田間與光照培養(yǎng)箱中抗青枯病過程蛋白質(zhì)組分的SDS-PAGE電泳比較

為進(jìn)一步明確兩種不同環(huán)境中植株發(fā)病前后發(fā)生顯著變化蛋白質(zhì)具體組分，本研究裁割FN2（未發(fā)病植株）、FI1（發(fā)病植株）SDS-PAGE泳道中分子量在50～60 kD之間發(fā)生顯著變化的條帶進(jìn)行蛋白質(zhì)膠條鑒定。

2.2 蛋白質(zhì)膠條鑒定結(jié)果

膠條鑒定結(jié)果顯示，兩個(gè)樣品的膠條分別鑒定出168和162種蛋白質(zhì)組分（表1）。99種組分在發(fā)病前后的植株均存在。69種組分僅在未發(fā)病植株中出現(xiàn)，63種組分僅在發(fā)病植株中出現(xiàn)。進(jìn)一步對(duì)這些已鑒定出的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。比較兩樣品間的差異。

2.3 GO分析

圖2為兩樣品各自鑒定出的蛋白質(zhì)組分的GO分析結(jié)果。比較兩者間的差異發(fā)現(xiàn)，兩樣品在不同的生物學(xué)過程中表達(dá)的蛋白質(zhì)數(shù)量有所不同。各個(gè)生物過程中未發(fā)病植株表達(dá)的蛋白質(zhì)數(shù)量幾乎都多于發(fā)病植株，僅在生物過程中的生物調(diào)節(jié)、生長、生物過程的調(diào)控和應(yīng)激響應(yīng)過程發(fā)病植株表達(dá)的蛋白數(shù)量多于未發(fā)病植株。發(fā)病植株胞外區(qū)細(xì)胞成分表達(dá)的蛋白質(zhì)數(shù)量比未發(fā)病植株多。未發(fā)病植株表達(dá)的蛋白質(zhì)分子功能以酶調(diào)節(jié)活性和結(jié)構(gòu)分子活性的蛋白質(zhì)數(shù)量居多。

表1 樣品鑒定結(jié)果

圖2 正常植株與發(fā)病植株的GO差異比較

圖3 正常植株與發(fā)病植株COG差異比較

2.4 COG分析

對(duì)這些差異蛋白進(jìn)行蛋白相鄰聚簇（COG）分析（圖3）。分析結(jié)果顯示，對(duì)于煙草抗青枯病品種DB101，植株發(fā)病以后，分子量大小在50～60 kD之間的相關(guān)蛋白質(zhì)主要在以下方面數(shù)量有所增加：核苷酸的運(yùn)輸代謝，運(yùn)輸和代謝的輔酶，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和合成，翻譯后修飾，蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、伴侶，次生代謝產(chǎn)物的合成、運(yùn)輸和代謝，防御機(jī)制等相關(guān)蛋白。除此以外，還有一些未知功能的蛋白質(zhì)在發(fā)病植株中可能對(duì)于作物抵御病原微生物的侵?jǐn)_起作用。

2.5 Pathway分析

綜合以上分析結(jié)果，發(fā)病植株中，有2個(gè)分子量大小在分子量在50～60 kD之間的蛋白質(zhì)與防御機(jī)制相關(guān)。本研究通過生物信息學(xué)途徑檢測分析其所在的代謝路徑。結(jié)果如圖4和圖5。圖中結(jié)果表明，這2個(gè)蛋白在組成剪切體的細(xì)胞核核糖核蛋白的合成和代謝通路中。同時(shí)與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子的合成與代謝也有關(guān)系。

圖4 可能參與青枯病防御機(jī)制的蛋白質(zhì)所在的代謝路徑（1）

圖5 可能參與青枯病防御機(jī)制的蛋白質(zhì)所在的代謝路徑（2）

3 討論

DB101在20世紀(jì)50年代育成于美國，其抗性較穩(wěn)定，是國內(nèi)煙草品種青枯病抗性鑒的抗病對(duì)照，然而其抗性機(jī)理卻未得到明確的闡析。本試驗(yàn)考察田間和人工氣候箱2個(gè)不同環(huán)境下，該品種發(fā)病植株在發(fā)病后與未發(fā)病植株相比其蛋白質(zhì)組分的變化趨勢，發(fā)現(xiàn)發(fā)病后植株的蛋白質(zhì)在分子量大小約為50～60 kD之間的部分蛋白發(fā)生明顯的變化；進(jìn)一步應(yīng)用蛋白質(zhì)膠條鑒定技術(shù)對(duì)該部分蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和生物信息學(xué)分析，得到該煙草青枯病抗病品種在抵御病原微生物入侵時(shí)基因表達(dá)引起的部分生理生化變化信息。

本試驗(yàn)僅選擇田間樣品作為蛋白質(zhì)膠條鑒定樣品，原因主要有以下2點(diǎn)：（1）SDS-PAGE指紋圖譜顯示，田間和人工氣候箱兩個(gè)不同環(huán)境中，發(fā)病植株與正常植株比較均發(fā)生相同的變化趨勢，即發(fā)病后的植株中分子量大小約為50～60 kD之間的蛋白質(zhì)組分發(fā)生明顯的消減。（2）田間環(huán)境中發(fā)病前后的蛋白質(zhì)變化趨勢雖然與人工氣候箱環(huán)境中的一致，但蛋白質(zhì)數(shù)量明顯比人工氣候箱環(huán)境中的少，因此選擇此環(huán)境中的樣品作為蛋白質(zhì)膠條鑒定對(duì)象，以考察在兩個(gè)不同環(huán)境中共同存在的煙草植株抵抗青枯病菌的相同蛋白質(zhì)組分變化趨勢。

本試驗(yàn)針對(duì)該品種發(fā)病前后發(fā)生顯著變化的部分蛋白質(zhì)組分進(jìn)行生物信息學(xué)分析，得到2個(gè)分子量大小在分子量在50～60 kD之間、與防御機(jī)制相關(guān)的蛋白。該蛋白主要存在于組成剪切體的細(xì)胞核核糖核蛋白的合成和代謝通路中，可能與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子的合成與代謝也有關(guān)系。植物ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白于1992年被首次報(bào)道，在植物生長素的極性轉(zhuǎn)運(yùn)、脂質(zhì)的降解、外源毒素的解毒、植物抗病和氣孔的功能調(diào)節(jié)等方面起作用[9-10]。水稻ABC1家族被證明參與非生物脅迫應(yīng)答，在逆境脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[11]。然而，未見關(guān)于該類蛋白是否與青枯病脅迫應(yīng)激響應(yīng)有關(guān)的相應(yīng)報(bào)道，因此該問題有待進(jìn)一步深入研究。

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