綠豆多糖制備及抗氧化特性研究

鐘 葵 曾志紅 林偉靜 王 強 周素梅

（中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193）

綠豆（Vigna radiatusL.）又名文豆、吉豆、青小豆，是菜豆族蝶形花亞科豇豆屬植物的一個栽培種。綠豆是我國傳統雜糧作物，產量和出口量均居世界首位，屬高蛋白、低脂肪、中淀粉作物，營養豐富，經濟利用價值高［1］。同時，綠豆具有良好食用及藥用價值，有“濟世之食谷”之說。傳統中醫認為綠豆味性干寒，內服具有清熱解毒、消炎、利水潤膚等功效［2］。現在醫學則認為綠豆在抑菌、降脂、抗腫瘤和解毒方面功效頗佳［3－6］。

目前綠豆功效研究文獻較少，大部分研究認為綠豆的生物活性成分主要是豆皮中的黃酮類和黃酮醇類物質［7－8］。也有報道表明，綠豆中還存在一類生物活性物質，就是多糖［9－11］。多糖（Polysaceharides）是一類具有廣泛生物活性的生物大分子物質，是構成生命活動四大基本物質之一，與維持生物機能密切相關。近年來，大量研究表明多糖具有免疫調節、抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、降血糖、抗凝血等作用，對機體毒副作用小，因此成為研究熱門領域，應用價值良好［12－13］。

體內過多的氧自由基會誘發脂質過氧化，使細胞膜結構受到損傷，并可能增加腫瘤、心血管疾病、類風濕性關節炎等疾病的發病率［14］。由于合成的抗氧化劑存在致癌、毒副作用等安全問題，從天然植物來源中篩選出高效、安全的天然抗氧化劑也是近幾年國內外的研究熱點［15］。綠豆多糖對羥自由基、DPPH和超氧自由基有較好清除效果，最高清除效果可達到90%以上［11］。目前綠豆多糖研究報道僅寥寥數篇，處于起步階段；且研究主要集中綠豆多糖抗氧化活性上，對于綠豆多糖提取工藝的優化缺乏相關報道。

通常，綠豆生物活性認為主要集中在種皮中，豆仁主要起到營養物質功效［7］。試驗前期研究發現，豆仁中同樣含有多糖，這部分多糖是否存在生理活性，與豆皮中多糖相比，生理活性存在哪些差異，目前尚不明確。本研究以豆仁為原料，優化多糖提取工藝，在此基礎上對制備的粗多糖進行分離純化，研究其多糖組分對自由基的清除效果，旨在為綠豆多糖的功能活性研究及開發利用打下理論基礎，對深化綠豆加工，豐富綠豆產品類型，提高綠豆附加值有積極作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆仁：市售，粉碎后 40目過篩，低溫干燥（55℃）至恒重后備用。

1，1－二苯基 －2－三硝基苯肼［1，1－Diphenyl－2－picrylhydrazyl radical 2，2－Diphenyl－1－（2，4，6－trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH］：分析純，Sigma化學公司；柱填料 DEAE－52纖維素、Sephadex G－100：Whatman公司；其他所用化學試劑、苯酚、硫酸、丙酮、氫氧化鈉、乙醚、無水乙醇等、分析純：北京化學試劑公司。

1.2 主要儀器

UV－2550紫外可見分光光度計：日本島津；RE－52AA旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；柱層析系統：上海滬西分析儀器廠；FA25實驗室高剪切分散乳化機：上海弗魯克流體機械制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理

豆仁粉用80%乙醇浸提6 h，再用95%乙醇、無水乙醇、丙酮和乙醚分別清洗，粉末置于室溫下24 h陰干，待用［11］。

1.3.2 綠豆仁多糖（AEMP）的堿法提取工藝

準確稱量2.0 g預處理綠豆仁粉于三角瓶中，按照一定比例的液料比加入適宜濃度的NaOH溶液，置于設置好溫度的恒溫水浴搖床中進行一定時間的提取。提取結束后于5 000 r／min離心15 min，收集上層清液。濾渣清洗2遍，離心后收集濾液，合并3次上層清液，用2層濾紙抽濾后減壓濃縮至原體積1／6。4倍體積的95%乙醇緩慢倒入濃縮液中，攪拌混合均勻，4℃下冷藏過夜，于5 000 r／min離心15 min，收集濾渣，醇洗5～6遍，得到AEMP。

1.3.3 綠豆仁多糖含量測定

提取得到的AEMP溶解于水，硫酸－苯酚法測定溶液中總糖含量［15］。最終，多糖得率以每克綠豆仁干重中葡萄糖當量來衡量（mg GE／g DW）。

1.3.4 響應面的試驗設計

在單因素試驗基礎上，根據BoX－Behnken中心組合試驗設計原理，進一步采用4因素3水平的響應面分析方法，以 NaOH 濃度 （moL／L）、液料比（mL／g）、提取溫度（℃）和提取時間（h）為自變量，分別以X1、X2、X3和X4表示，并以 －1、0、＋1分別代表自變量的低、中、高水平，按方程Xi＝（Xi－X0）／X對自變量進行編碼。其中Xi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實值，X0為試驗中心點處自變量的真實值，X為自變量的變化步長，因子編碼及水平見表1。選取各因素適當的水平后，采用Design－Expert軟件進行試驗設計，按優化后的29組試驗條件，以AEMP得率作為評判標準展開響應曲面分析，以確定各因素對AEMP得率的顯著性和各培養條件的最佳組合，優化堿法提取AEMP的工藝條件。

表1 因素水平設計

1.3.5 AEMP分離純化

取少量AEMP溶解于蒸餾水，濃度為10 mg／mL，0.45μm過濾膜過濾，上DEAE－52纖維素離子柱，柱規格為60×2.6 cm，上樣量 5 mL，洗脫液流速1 mL／min，依次用蒸餾水和 0.3 mol／L的 NaCl溶液進行階段洗脫，每管收集8 mL，苯酚－硫酸法每管跟蹤檢測洗脫液中多糖含量，直至檢測無洗脫峰為止。合并主要吸收峰的洗脫液，濃縮后透析48 h除鹽，定容組分溶液濃度為5 mg／mL，依次上Sephadex G－100凝膠柱，柱規格為60×2.6 cm，上樣量5 mL，洗脫液流速0.4 mL／min，蒸餾水洗脫，每管收集4 mL。苯酚－硫酸法每管跟蹤檢測洗脫液中多糖含量，直至檢測無洗脫峰為止。收集合并主要吸收峰的洗脫液，濃縮后蒸餾水透析48 h，冷凍干燥，最終收集得到純化組分。

1.3.6 抗氧化活性

1.3.6.1 羥自由基［16］

在試管中加入0.5 mL、9.1 mmol／L的水楊酸－乙醇溶液，0.5 mL樣品溶液，0.5 mL、9.1 mmol／L的Fe2＋溶液，3.5 mL蒸餾水，再加入 5 mL、8.8 mmol／L的H2O2，顯色振蕩搖勻后，于510 nm測定吸光值，計算清除效果。清除效果計算公式如下：

式中：A0（以樣品溶劑代替樣品）為空白樣測定值；As為樣品測定值。

1.3.6.2 DPPH（二苯基三硝基苯肼自由基（DPPH·）自由基［17］

將1.5 mL多糖樣品溶液添加至1.5 mL、0.1 mmol／L的DPPH 95%乙醇溶液中，漩渦混合振蕩后，室溫放置30 min，于517 nm下測定溶液的吸光值。公式如下：

式中：A1為DPPH＋樣品的吸光值，A2為95%乙醇＋樣品的吸光值，A3為DPPH＋蒸餾水的吸光值。

使用同樣方法測定現配抗壞血酸溶液的羥自由基和DPPH的清除能力，作為對照。

1.4 數據分析

試驗數據采用BoX－Behnken的中心組合試驗設計，分析和作圖軟件使用 Design－Expert 6.0.5軟件和Origin7.5。數據分析采用方差分析（ANOVA），所有試驗均重復3次。

2 結果與討論

2.1 綠豆多糖提取工藝優化

綠豆仁中淀粉含量高，達到50%～60%，會對多糖提取及多糖純度造成干擾。堿法是淀粉提取常用方法之一，大量研究表明堿處理也能顯著提高多糖的得率［17］。試驗中采用堿法同時提取多糖和淀粉，再通過離心達到去除淀粉的目的。目前堿法提取多糖文獻較多，研究結果表明NaOH濃度、料液比、提取溫度和時間幾個單因素對得率影響較為顯著［18］，因此試驗前期研究了這4個單因素對AEMP得率影響，并選取其設計響應面試驗，為BoX－Behnken設計提供適宜取值范圍。最終選取水平設置如表1，優化后的29組試驗設置和結果見表2。

表2 響應值分析結果

利用Design－EXpert軟件對表2試驗數據進行多元回歸擬合，得到AEMP得率對NaOH濃度、料液比、提取溫度和時間的二次多元回歸方程為：

Y＝6．31＋0．26X1－0．27X2＋0．57X3－1．55X4－1．46X12＋1．28X22－0．14X32＋0．23X42＋0．03X1X2－0．92X1X3－0．98X1X4＋0．37X2X3－0．63X2X4－0．30X3X4

表3是該回歸模型方差分析結果。由表3可知，模型的F＝16.90（P＜0.000 1），表明該模型方程極顯著，不同因素間差異極顯著（P＜0.01）；模型失擬項F＝1.66（P＞0.05），表明失擬項不顯著（P＞0.05）；模型校正決定系數R2Adj＝0.888，表明該模型擬合程度良好，試驗誤差小。方差分析表明，該模型能較好的反映提取因素液料比、浸提時間和轉速和綠豆多糖AEMP得率之間關系。

表3 回歸模型方差分析

表4列出了回歸模型系數顯著性檢驗結果。結果表明，模型的一次項X3、X4和二次項X12、X22顯著（P＜0.05），各因素對多糖得率影響X4＞X3＞X2＞X1，即處理時間對AEMP得率影響最大，其次是溫度和液料比，最后是NaOH濃度。交互項X1X3、X1X4和X2X4極顯著（P＜0.05），表明堿液濃度和溫度、處理時間之間、液料比和處理時間之間存在極顯著交互作用，各影響因素對于AEMP得率非簡單線性關系。

表4 回歸模型系數顯著性檢驗

通過軟件分析，得到AEMP最佳提取工藝條件為堿液濃度 0.02 mol／L，液料比 19.99∶1 mL／g，提取溫度50℃，提取時間3 h；在此工藝條件下，綠豆多糖得率的理論值可達9.74 mg GE／g DW；為檢驗響應面法所得結果可靠性，同時考慮實際操作的便利，將最佳提取參數修正為：堿液濃度0.02 mol／L，液料比20∶1 mL／g，提取溫度50℃，提取時間3 h，最終多糖得率為9.70 mg GE／g DW，與理論預測值比較誤差不顯著（P＞0.05），表明試驗設計和響應面法優化得到的提取工藝參數準確可靠，具有實用價值。

2.2 綠豆多糖分離純化

通過2.1制備的綠豆粗多糖純度為65%，要得到純度更高的多糖需要進一步純化。本研究采用柱層析法進一步分離和純化AEMP。首先用DEAE－52纖維素離子交換柱層析，依次用蒸餾水和0.3 mol／L NaCl溶液階段洗脫，分離得到1個水洗脫多糖組分AEMP－1′和1個鹽洗脫多糖組分AEMP－2′（圖1a），糖含量分別為47.01%和52.99%。將收集到的2個多糖組分分別經由Sephadex G－100凝膠柱進一步層析，蒸餾水洗脫，結果如圖1b。由圖1可見，AEMP－1′和AEMP－2′經蒸餾水洗脫后均顯示單一峰，且峰形較為對稱，2個組分分別命名為AEMP－1和AEMP－2，其多糖含量分別為52.51%和47.49%。

圖1 AEMP及其組分的DEAE－52纖維素和Sephadex G－100層析柱洗脫曲線圖

綠豆多糖組分AEMP－1′和AEMP－2′色澤為白色，理化反應結果為均較易溶解于水，不溶于乙醇、丙酮等有機溶劑，不含淀粉和酚類物質。苯酚－硫酸法測定AEMP－1和AEMP－2中多糖含量分別為（92.89±2.89）%和（90.58±3.44）%。

2.3 綠豆多糖的抗氧化活性

自由基清除率是傳統的抗氧化能力測定方法之一，廣泛用于抗氧化物質自由基清除能力的測定［19］。圖2和圖3探討了AEMP及其純化組分（AEMP－1和AEMP－2）對羥自由基和DPPH自由基的動態清除反應過程。

圖2 AEMP及其純化組分對羥自由基清除效果

AEMP及純化后組分對羥自由基均具有良好清除效果，隨多糖濃度增加清除效果顯著增強（圖2），最高羥自由基清除率達到了 55.32%（AEMP）、75.05%（AEMP－1）和79.81%（AEMP－2）（多糖濃度為5 mg／mL時）。純化后多糖組分AEMP－1和AEMP－2羥自由基清除率顯著高于未純化多糖AEMP，但兩個組分之間差異不顯著。陽性對照抗壞血酸濃度為2 mg／mL時，羥自由基清除率達到90%以上，顯著高于AEMP及純化后組分。AEMP及純化后組分對DPPH清除效果與羥自由基類似，隨濃度增加清除效果顯著增強（圖3）。

圖3 AEMP及其純化組分對DPPH自由基清除效果

多糖純化后的多糖組分AEMP－1和AEMP－2清除效果顯著優于AEMP，最高DPPH清除率達到了58.49%（AEMP）、70.28%（AEMP－1）和 80.16%（AEMP－2）（800μg／mL），且多糖組分 AEMP－2

清除率顯著高于AEMP－1。相同劑量下，AEMP及其組分的對DPPH自由基的清除效果均不及相同劑量下的抗壞血酸。

自由基半數抑制濃度IC50值是自由基抑制率為50%時所對應的多糖的濃度，通常用于衡量多糖清除自由基能力的強弱［15］。IC50值越小，表明多糖的抗氧化能力越強。利用Originlab7.0軟件擬合樣品濃度與清除率的量效關系，通過擬合曲線計算得到綠豆多糖AEMP及其純化組分對羥自由基和DPPH自由基的IC50值，具體數值如表5所見。純化組分AEMP－2自由基清除效果最優，清除羥自由基和DPPH的 IC50值分別為（4.71±0.15）mg／mL和（1.03×10－1±1.21×10－3）mg／mL，顯著 低于AEMP及純化組分AEMP－1。

表5 綠豆多糖及其純化組分清除自由基的IC50值／mg／mL

通常，綠豆生物活性認為主要集中在種皮中，豆仁主要起到營養物質功效。有報道表明綠豆皮中多糖成分進行分離和純化后得到多糖組分MP－1（中性）和MP－2（酸性）具有良好的抗氧化效果，MP－1的抗氧化活性最高，對羥自由基和DPPH清除率分別達到 90%（5 mg／mL）和 80%（800μg／mL）左右［11］。本試驗中，豆仁中多糖組分AEMP－2相同濃度下對羥自由基和DPPH清除率均80%左右，與豆皮中活性最高組分MP－1差別不大，表明綠豆仁中同樣含有生物活性成分多糖成分，其抗氧化功效與豆皮中多糖組分相當。因此，豆仁是集營養與生物活性一身的作物。后期將進一步開展活性組分AEMP－1的結構相關研究，以其獲得AEMP構效關系的相關信息。

3 結論

3.1 建立了一個堿法提取綠豆仁中多糖成分的最佳工藝條件，即堿液濃度0.02 mol／L，液料比 20 mL／g，提取溫度50℃，提取時間3 h，最終多糖得率為9.70 mg GE／g DW，與模型預測值基本相符。因此，采用RSM法優化得到的堿提參數準確、可靠，具有較好的實用價值，對綠豆仁中多糖成分的研究與開發利用具有重要意義。

3.2 采用DEAE－52纖維離子色譜和Sephadex G－100凝膠色譜柱分離純化AEMP，得到兩個多糖組分AEMP－1和AEMP－2，其多糖含量分別為（92.89±2.89）%和（90.58±3.44）%。

3.3 AEMP－及其純化組分AEMP－1和AEMP－2對羥自由基和DPPH自由基均有較好清除效果，表明具有良好抗氧化活性。AEMP－2抗氧化活性最強，對羥自由基和DPPH自由基半數抑制濃度IC50值分別為4.71 mg／mL和1.03×10－1mg／mL，對DPPH自由基清除效果優于羥自由基，是一種具有開發潛力的天然抗氧化劑。

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