甘三酯指紋圖譜相似度在芝麻油摻混檢測中的應用

皇甫志鵬 薛雅琳 劉元法 張 東

(江南大學食品學院1，無錫 214122)

(國家糧食局科學研究院2，北京 100037)

我國是芝麻種植和消費大國，芝麻的產量和單產均居于世界首位［1］。芝麻油因其濃郁而獨特的氣味、滋味和良好的口感，深受我國消費者的青睞，同時由于芝麻油市場售價很高，所以有不法商販將其他廉價油脂摻入芝麻油中，不僅嚴重損害了消費者的利益，而且影響了芝麻、芝麻油產業的長遠發展。為了保護消費者、誠信生產經營者的利益和芝麻油產業的長遠發展，迫切需要建立科學、準確、適用廣泛的油脂摻混分析檢測體系。

國內針對芝麻油的摻混做了大量的工作［2］，主要集中在摻混油脂與純芝麻油脂肪酸組成的測定，此方法對大豆油和菜籽油摻入的檢驗有一定的效果，但是對葵花籽油摻入的檢驗效果較差［3］。

油脂中的甘三酯立體結構對油脂的性質影響很大。近年來，國外亦針對橄欖油摻混的檢驗做了大量的工作［4］，較有成效的研究則集中在對橄欖油甘三酯指紋圖譜的測定，當其他油脂以3%～10%的比例摻入橄欖油時［5］，通過比對甘三酯指紋圖譜相似度，即可作出是否為摻混油脂的準確判定。試驗對甘三酯指紋圖譜相似度在芝麻油摻混中的應用展開研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

芝麻、芝麻油、大豆油、葵花籽油、玉米油、花生油:市售。

1.2 主要儀器、試劑

2695高效液相色譜儀(配有二元溶劑管理器、樣品管理器、柱溫箱、2424 ELSD檢測器、Empower數據處理系統):Waters公司;Agilent 1260－Agilent 6510 Q－TOF液質聯用系統:Agilent公司;丙酮、乙腈、異丙醇、己烷:色譜純，Fisher Scienctific公司;MTBE(甲基叔丁基醚):色譜純，Dikma公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的制備

純芝麻油:將芝麻油樣品溶于己烷(色譜純)，配制成10 mg/mL的己烷溶液，過0.45 μm聚四氟乙烯濾膜后用于甘三酯分析。

摻混油脂:將其他油脂以一定的比例混入芝麻油中，將摻混的樣品在振蕩器中震蕩60 s，然后用手上下劇烈震蕩20 s，再在振蕩器中震蕩60 s，后溶于己烷(色譜純)，配制成10 mg/mL的己烷溶液，震蕩30 s，過0.45 μm聚四氟乙烯濾膜后用于甘三酯分析。

1.3.2 HPLC －ELSD分析甘三酯

色譜條件:色譜柱:Waters Symmetry 300TMC18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);柱溫:45 ℃;流動相:A:乙腈，B:異丙醇∶MTBE=8∶2;流速:1.2 mL/min;檢測器:漂移管溫度80℃，N2壓力30 psi，增益135。

1.3.3 甘三酯定性、定量分析

1.3.3.1 定性分析:將混合油脂樣品進行 HPLCAPCI－MS定性分析，通過出峰順序及峰形的比對，確定相同液相條件下的甘三酯組分。

采用大氣壓化學電離(APCI)離子源和四級桿飛行時間(Q－TOF)質量檢測器，根據甘三酯在質譜中斷裂的規律可對甘三酯分子做出準確的定性分析。

質譜條件:采集模式:APCI+，采集范圍:100～1 000 amu;干燥氣溫度350℃，干燥氣流速10 L/min，氣化溫度400℃;電暈電流4 μA。

1.3.3.2 定量分析:采用面積歸一化法，以HPLCELSD圖譜中甘三酯峰面積百分比(%)作為相應種類甘三酯含量。

1.3.4 試驗精密度

將純芝麻油或摻混油脂按1.3.1的樣品制備方法制備樣品，獨立進樣5次，測定各甘三酯組分的百分比，以驗證方法的重復性，試驗精密度以各組分的RSD值表示。

1.4 芝麻油摻混的檢驗

利用甘三酯指紋圖譜相似度檢驗芝麻油摻混，具體做法:測定純品芝麻油的甘三酯組成(本試驗中共33個芝麻油樣品)，建立芝麻油甘三酯數據庫;配制不同濃度梯度的摻混芝麻油，測定摻混芝麻油的甘三酯組成;根據實際情況，確定摻混油脂各甘三酯組分的權重;利用加權向量夾角余弦法計算摻混芝麻油甘三酯組成與純品芝麻油甘三酯組成的相似度;用所得的系列相似度值作出芝麻油摻混各種植物油的擬合曲線或求出擬合公式。

2 結果與討論

2.1 HPLC－ELSD分析條件的選擇與確定

根據 AOCS Official Method Ce 5c－93 方法［6］，甘三酯的分析采用乙腈和丙酮作為流動相，實際分析過程中，采用乙腈－丙酮作為流動相的分析時間較長，達到良好的分離效果需要45～55 min，且丙酮屬于易制毒溶劑并具有較大的毒性，故考慮用其他溶劑代替，經過初期的探索，最終確定以異丙醇 ∶MTBE(甲基叔丁基醚)=8∶2作為代替丙酮的流動相。

試驗發現，采用1.0 mL/min的流速時，分析時間較長，采用1.5 mL/min的流速時，甘三酯分離效果不理想，采用1.2 mL/min的流速時，分離效果良好，且分析時間較短，故最終確定流速為1.2 mL/min。

在1.2 mL/min流速下，將 40、45、50 ℃ 3種柱溫進行比對，發現40℃時，甘三酯峰形較寬，50℃時分離效果不理想，故確定采用45℃柱溫。

首先以A∶B=3∶7進行等度洗脫，探索梯度條件，最終確定梯度，見表1。

表1 梯度條件

以上條件下，甘三酯分析時間短，分離度良好，芝麻油各甘三酯組分的分離效果如圖1。由圖1可見，芝麻油的主要甘三酯峰形和分離度良好，做到了基線分離，有利于甘三酯組分含量的測定。

圖1 芝麻油的甘三酯圖譜

2.2 HPLC－APCI－MS對甘三酯定性分析

圖2 甘三酯斷裂規律

質譜檢測器具有非常高靈敏度，對于分析甘三酯非常合適，它的優勢在于能產生對分析結果有用的離子，如提供分子質量信息的分子離子、脂肪?；x子及一些單?；视碗x子和二酰基甘油離子等，根據這些離子特征可準確判斷甘油酯類型、脂肪酸組成及其位置分布。甘三酯在APCI質譜中斷裂形成碎片離子如圖2所示［7］。

根據這些斷裂規律，可對甘三酯組分做出準確的定性分析，分析結果見表2。

表2 混合油脂甘三酯分析結果

2.3 試驗精密度

按1.3.4的方法進行純芝麻油和混合油脂的精密度試驗，獨立進樣5次，結果用甘三酯組分的質量分數(%)表示，結果如表3、表4。

由以上結果可知，甘三酯各組分含量的測定RSD值范圍良好，均在液相色譜系統RSD值以下，試驗方法穩定性良好，精密度高，適合基于甘三酯圖譜相似度的油脂摻混檢驗工作的長期開展。

2.4 芝麻油摻混的檢驗

2.4.1 純芝麻油甘三酯數據庫的建立

按1.3.2的方法測定供試33個芝麻油樣品的甘三酯組成，建立數據庫，其組成范圍如表5。

2.4.2 指紋圖譜相似度的計算

當不同油脂以一定的梯度比例混入芝麻油時，其甘三酯組分的變化規律不盡相同，因此，在計算摻混油脂和純芝麻油的指紋圖譜相似度時，需要將不同的權重分配給甘三酯各個組分，具體的權重選取需滿足以下原則［8］:權重需結合實際情況應用層次分析法選取;相對變化率大的甘三酯組分權重大，反之亦然;變化明顯的甘三酯組分的實際含量與權重的乘積應在同一數量級且乘積與甘三酯性對變化率的大小相符合。

表3 芝麻油5次獨立試驗及RSD

表4 5%大豆油－芝麻油摻混油脂5次甘三酯分析及RSD

表5 33個芝麻油樣品甘三酯組分范圍

指紋圖譜的相似度的比對不能僅通過簡單的含量比較，需引入加權向量夾角余弦的計算和比對方法，以摻混油脂和芝麻油數據庫之間的加權向量夾角余弦值表示芝麻油指紋圖譜的相似度，進行摻混油脂的檢驗，相似度的計算見公式(1)。

式中:Xi為某個樣品對應保留時間下的峰面積或峰高;Yi為n批樣品(n≥10)對應保留時間下的平均峰面積或峰高(對照指紋圖譜)。

2.4.3 大豆－芝麻油的摻混檢驗

將大豆油按表6的比例摻入芝麻油，按1.3.1和1.3.2的方法制備、分析樣品，其甘三酯組成見表5。

由表5可知，大豆油摻入芝麻油時，出現新的組分 LLLn，定性效果明顯，而 LLL，PLL，OOO，SOL，SSL甘三酯組分相對變化率較大，且和芝麻油有較大差異，因此，這些組分的權重應較高，具體權重的分配如表7。

將甘三酯組分的含量與其權重相乘，得到加權甘三酯組成，并按公式1計算指紋圖譜的相似度，結果如表8。

分析表7的數據可知，用于摻混試驗的芝麻油和芝麻油數據庫的相似度為0.996，這是因為芝麻油甘三酯數據庫中各甘三酯組成有一定的波動范圍，單一芝麻油樣本和數據庫的相似度很高，但不可能為1，這點與實際情況相符。當大豆油的摻入量達到3%時，其相似度大幅下降，能準確做出是否是摻混油脂的判定。

表6 摻混大豆－芝麻油甘三酯組成

表7 摻混大豆－芝麻油各甘三酯組分權重

表8 大豆－芝麻摻混油脂加權甘三酯組成及相似度

將指紋圖譜相似度和摻入量進行回歸運算，結果如圖3所示。

圖3 大豆－芝麻油指紋圖譜相似度和摻入量的擬合曲線

擬合公式為 Y=0.035 4X3－0.181 8X2+3.631 3X －3.866 7，R2=0.997 3。

由以上試驗可知，大豆－芝麻摻混油脂的指紋圖譜和純芝麻油有明顯的差別，即使是少量(3%)的大豆油摻入芝麻油時，其指紋圖譜相似度也和純芝麻油有較大的差距。大豆－芝麻油指紋圖譜相似度與摻入量的擬合曲線的R2=0.997 3，擬合曲線準確可靠，此方法適用于大豆－芝麻油的摻混檢驗。

2.4.4 葵花籽－芝麻油的摻混檢驗

將葵花籽油按表8的比例摻入芝麻油，按1.3.1和1.3.2的方法制備、分析樣品，其甘三酯組成如表9。

由表 9可知，葵花籽油摻入芝麻油時，LLL，OOO，SOL，POO等甘三酯組分相對變化率較大，且和芝麻油有差異，因此，這些組分的權重應較高，具體權重的分配如表10。

將甘三酯組分的含量與其權重相乘，得到加權甘三酯組成，并按公式1計算指紋圖譜的相似度，結果如表11。

表9 摻混葵花籽－芝麻油甘三酯組成

表10 摻混葵花籽－芝麻油各甘三酯組分權重

表11 大豆－芝麻摻混油脂加權甘三酯組成及相似度

由表11可知，當芝麻油中葵花籽油的摻入量達到3%時，其指紋圖譜相似度為0.906，摻混檢驗效果與大豆－芝麻油相比較差，但仍能做出摻混油脂的準確判定。

將指紋圖譜相似度和摻入量進行回歸運算，結果如圖4所示。

圖4 葵花籽－芝麻油指紋圖譜相似度和摻入量的擬合曲線

擬合公式為 Y=0.401 5X2+0.940 9X －0.833 3，R2=0.995 8

由以上試驗可知，葵花籽油－芝麻摻混油脂的指紋圖譜和純芝麻油有明顯的差別，即使是少量(3%)的葵花籽油油摻入芝麻油時，其指紋圖譜相似度也和純芝麻油有較大的差距，。大豆－芝麻油指紋圖譜相似度與摻入量的擬合曲線的R2=0.997 3，擬合曲線準確可靠，此方法適用于大豆－芝麻油的摻混檢驗。

3 結論

以HPLC－ELSD法采用合適的分離條件可以很好的分離油脂的甘三酯組分，應用HPLC－APCIMS方法可以對甘三酯各組分做出準確的定性，從而獲得油脂的甘三酯指紋圖譜。

以純芝麻油的甘三酯指紋圖譜作為主要指標建立純芝麻油的數據庫，通過計算摻混芝麻油與純芝麻油數據庫的甘三酯指紋圖譜相似度，可以很好的檢驗摻混芝麻油，試驗表明，當大豆油，葵花籽油對芝麻油的摻入比例達到3%時，即可對摻混芝麻油做出準確的判定。

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