蠅蛆粉和L－肉堿對青魚生長、免疫與抗氧化指標及抗病力的影響

明建華 葉金云 張易祥 楊 霞 吳成龍 邵仙萍 劉 沛

(湖州師范學院生命科學學院1，湖州 313000)

(大連海洋大學水產與生命學院2，大連 116023)

隨著水產養殖業向集約化、規模化方向發展，養殖環境中的各種脅迫因子不斷增多，易導致養殖動物病害滋生，而抗生素和化學合成消毒劑的使用會造成耐藥性和藥物殘留等諸多問題。因此，通過營養調控手段來提高魚類的免疫力和抗應激能力日益受到重視。蠅蛆不僅蛋白質與氨基酸含量高，而且體內還含有抗菌肽、幾丁糖、凝集素等具有免疫調節功能的物質［1－4］。王娓等［2］研究發現，蠅蛆可以顯著提高中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)的抗桿狀病毒感染能力，激活對蝦的酚氧化酶系統。陳乃松等［3］以少量蠅蛆粉替代魚粉飼喂凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)，在一定程度上提高了對蝦抵抗弧菌的能力，但對蝦生長和飼料效率無正面影響。張洪玉等［4］研究表明，蠅蛆可顯著提高中國對蝦的生長速度，并增強抗白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus，WSSV)的感染力。L－肉堿(β－羥基－γ－三甲胺丁酸)是一種多功能的綠色飼料添加劑，主要參與機體的能量代謝，是脂肪酸進入線粒體進行β－氧化的載體，可以加速脂肪的氧化，具有節約蛋白質、促進生長等作用［5］。近些年來，人們發現L－肉堿還具有抗細胞凋亡、免疫調節及抗氧化等功能［6－7］。

青魚(Mylopharyngodon piceus Richardson)是我國傳統淡水養殖的“四大家魚”之一，據《2011中國漁業統計年鑒》，我國養殖青魚年產量為42.4萬t。近年來青魚養殖病害有逐年上升的趨勢，而有關蠅蛆粉、L－肉堿作為青魚免疫增強劑的相關研究在國內外尚未見報道。鑒于此，本試驗在青魚飼料中分別添加蠅蛆粉和L－肉堿，探討其對青魚魚種生長、免疫和抗氧化指標以及抗病原菌感染能力的影響，以期為研制安全環保的飼料添加劑提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗魚種、添加劑及日糧

青魚:湖州荻港徐緣生態旅游開發有限公司水產養殖部。試驗選擇270尾體質健壯，規格和體重基本一致的青魚魚種，初始體重(72.23 ±1.81)g，隨機分成3組，即對照組、蠅蛆粉組和L－肉堿組，每組設3個重復，分別飼養于設置在15畝池塘的9只網箱(規格為 3.0 m ×2.0 m ×1.5 m，水深 1.0 m)中，每只網箱放養30尾。

蠅蛆粉購自浙江德清綠態農業科技有限公司，含干物質為93.27%、粗蛋白為53.46%，粗脂肪為22.4%;L－肉堿由北京桑普生物化學技術有限公司提供，有效質量分數為20%。

試驗飼料組成及主要營養成分見表1，3種飼料等氮等能，以基礎日糧飼喂對照組，其余2組分別投喂添加蠅蛆粉25 g/kg、L－肉堿150 mg/kg(有效含量)的試驗飼料。各種原料分別粉碎過60目篩，采取逐級擴大法添加微量成分，使各組分充分混勻后，用小型飼料造粒機制成粒徑2 mm的沉性顆粒飼料，40℃烘干后于4℃冰柜中保存備用。

表1 試驗飼料組成及營養水平(風干基礎，%)

1.2 飼養管理

青魚魚種在池塘網箱中馴養7 d后投喂試驗飼料。每天投喂2次(8∶30、16∶30)，日投飼量為魚體重2%～5%，并根據水溫、氣候變化及魚類攝食情況作適當調整，以每次投飼后1 h無殘餌為宜。飼養期間水溫為26～29 ℃，pH 為6.8～7.6，溶解氧 ＞5 mg/L，氨氮＜0.05 mg/L。正式養殖60 d后結束，測定魚體長和體重。

1.3 攻毒試驗

病原菌采用浙江省淡水水產研究所提供的嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophi1a)。按王文博等［8］所述方法，將兩次活化后的嗜水氣單胞菌用無菌生理鹽水稀釋，使終濃度為1×107cells/mL。飼養試驗結束后，選擇體重基本一致的青魚進行攻毒試驗，每只網箱取10尾魚，按每100 g魚重腹腔注射菌液0.5 mL;另外從對照組的每個網箱中再選取5尾青魚注射相同劑量生理鹽水作為攻毒對照。觀察1周，統計各組魚的死亡率和相對保護率。

1.4 采樣與處理

飼養試驗結束后，禁食24 h，將各網箱魚稱重計數，每箱隨機選取4尾體重相近的青魚，用濃度為200 mg/L的MS－222作快速深度麻醉，經稱重和量體長后用一次性醫用注射器從尾靜脈采血。血樣在4℃冰箱中靜置1～2 h后，以4℃ 3 000 r/min離心10 min制備血清，－20℃凍存備用。魚體采血后立即剖開腹腔，剝離出內臟和肝胰臟并稱重，取適量肝臟用于常規分析，取部分背鰭下方側線以上的背部肌肉用于肌肉成分分析，均以－20℃保存。

1.5 測定指標與方法

1.5.1 相關指標的計算公式

分別按下式計算增重率、特定生長率、飼料系數、成活率、肝體比、內臟比、肥滿度、死亡率和相對保護率。

增重率=(Wt－W0)/W0×100%

特定生長率=(lnWt－lnW0)/t×100%

飼料系數=FI/(W2+W3－W1)

成活率=Nt/N0×100%

肝體比=Wh/Wb×100%

內臟比=Wv/Wb×100%

肥滿度=Wb/L3×100%

死亡率=Nd/Ni×100%

相對保護率=(Mc－Mt)/Mc×100%

式中:W0為魚初體均重/g;Wt為魚末體均重/g;t為飼喂天數/d;FI為每箱魚攝食飼料總量/d;W1為每箱魚初體總重/d;W2為每箱死魚的總重/d;W3為每箱魚末體總重/d;N0為初魚尾數;Nt為末魚尾數;Wh為每尾魚末肝臟重/d;Wv為每尾魚末內臟重/d;Wb為每尾魚末體重/d;L為每尾魚末體長/cm;Nd為攻毒后死亡魚尾數;Ni為受感染魚尾數;Mc為對照組魚死亡率/%;Mt為試驗組魚死亡率/%。

1.5.2 飼料和肌肉樣品成分分析

水分含量采用105℃烘箱干燥法(GB 6435—1986)測定;粗蛋白質含量采用微量凱氏定氮法(GB/T 6432—1994)測定;粗脂肪含量采用索氏抽提法(GB/T 6433—1994)測定;粗灰分含量采用550℃灼燒法(GB/T 6438—1992)測定;磷含量采用鉬黃分光光度法(GB/T 6437—2002)測定;總能利用氧彈測熱儀測定。

1.5.3 血液生化指標的測定

總蛋白(TP)、溶菌酶(LSZ)、堿性磷酸酶(AKP)、補體C3和C4、谷丙轉氨酶(GPT)和谷草轉氨酶(GOT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH－Px)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)等在美國貝克曼Cx－4型全自動生化分析儀上測定，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.5.4 肝臟抗氧化指標的測定

肝臟樣品解凍后，用冷生理鹽水沖洗干凈并用濾紙吸干后稱重，肝臟與勻漿介質(pH 7.4)按1∶9(W∶V)的比例冰浴勻漿，制成10%勻漿液，然后4℃4 000 r/min離心10 min，取上清液用于分析。青魚肝臟SOD、GSH–Px、CAT和MDA的水平均用南京建成生物工程研究所的相應試劑盒測定。

1.6 數據統計與分析

試驗數據用SPSS 13.0統計軟件包中的單因素方差分析(one－way ANOVA)和 D uncan氏多重比較，P﹤0.05表示差異顯著。試驗結果以平均值±標準差(±SD)表示。

2 結果與分析

2.1 蠅蛆粉和L－肉堿對青魚生長性能的影響

從表2可見，與對照組相比，蠅蛆粉和L－肉堿組青魚增重率和特定生長率均顯著提高(P＜0.05)，其中增重率分別提高了17.31%、13.98%，而特定生長率分別提高了10.59%、8.82%。蠅蛆粉和L－肉堿組的飼料系數較對照組分別顯著下降了11.29%、13.44%(P＜0.05)。飼料中添加蠅蛆粉和L－肉堿有提高青魚成活率的趨勢(P＞0.05)。在形體指標上，蠅蛆粉和L－肉堿組魚體肝體比、內臟比和肥滿度與對照組相比差異均不顯著(P＞0.05)，但有下降趨勢。由此可見，蠅蛆粉和L－肉堿均可促進青魚的生長，降低飼料系數，但對魚體形體指標無顯著影響。

表2 蠅蛆粉和L－肉堿對青魚生長及形體指標的影響

2.2 蠅蛆粉和L－肉堿對青魚肌肉成分的影響

由表3可知，與對照組相比，蠅蛆粉和L－肉堿組青魚肌肉粗蛋白含量有升高的趨勢，而水分、粗脂肪和灰分的含量有下降趨勢(P＞0.05)。可見，蠅蛆粉和L－肉堿對青魚肌肉成分無顯著影響。

表3 蠅蛆粉和L－肉堿對青魚肌肉成分的影響

2.3 蠅蛆粉和L－肉堿對青魚血清免疫指標的影響

由表4可知，與對照組相比，蠅蛆粉和L－肉堿組魚血清總蛋白、溶菌酶的水平均顯著提高(P＜0.05)，其中總蛋白含量分別提高了21.50%、18.70%，溶菌酶活性則分別提高了21.45%、14.52%。蠅蛆粉組魚血清堿性磷酸酶的活性也較對照組顯著提高了13.21%(P＜0.05)，而L－肉堿組與對照組的差異不顯著(P＞0.05)。蠅蛆粉和L－肉堿組魚血清補體 C3、C4的活性均顯著高于對照組，且蠅蛆粉組補體C4的活性還顯著高于L－肉堿組的水平(P＜0.05)。蠅蛆粉和L－肉堿組血清谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶活性均較對照組低，但差異均不顯著(P＞0.05)。由此可見，蠅蛆粉和L－肉堿均可不同程度地提高青魚血清總蛋白、溶菌酶、堿性磷酸酶以及補體C3、C4的水平，從而增強魚體的非特異性免疫力。

表4 蠅蛆粉和L－肉堿對青魚血清免疫指標的影響

2.4 蠅蛆粉和L－肉堿對青魚血清和肝臟抗氧化指標的影響

由表5可知，在血清中，蠅蛆粉組SOD和CAT的活性顯著高于對照組(P＜0.05)，分別比對照組提高了19.77%、36.10%，而L－肉堿組SOD 和CAT的活性與對照組的差異均不顯著(P＞0.05);蠅蛆粉和L－肉堿組GSH－Px的活性分別比對照組顯著提高了20.94%、28.63%，而MDA的含量則分別比對照組顯著下降了 17.61%、22.09%(P ＜0.05)。在肝臟中，蠅蛆粉和L－肉堿組青魚SOD、GSH－Px和CAT的活性均顯著高于對照組，而MDA的含量則均顯著低于對照組(P＜0.05)。由此可見，蠅蛆粉和L－肉堿均可提高青魚血液和肝臟的抗氧化能力。

表5 蠅蛆粉和L－肉堿對青魚血清和肝臟抗氧化指標的影響

2.5 蠅蛆粉和L－肉堿對青魚感染嗜水氣單胞菌后的保護作用

由表6可知，青魚人工注射感染嗜水氣單胞菌1周后，對照組魚的死亡率為90.00%，而蠅蛆粉和L－肉堿組青魚的死亡率分別為63.33%、66.67%，相對保護率分別為29.63%、25.92%。對照組中注射生理鹽水的青魚沒有發生死亡現象，可排除試驗操作導致的青魚死亡。可見，蠅蛆粉和L－肉堿可增強魚體的抗病原感染力，對青魚有一定的免疫保護作用。

表6 蠅蛆粉和L－肉堿對青魚感染嗜水氣單胞菌后的保護作用

3 討論

3.1 蠅蛆粉和L－肉堿對青魚生長性能的影響

蠅蛆粉在已有的研究報道中主要作為蛋白源的替代。馬建品等［9］用含25%蠅蛆粉的顆粒飼料飼喂草魚(Ctenopharyngodon idellus)，與含20%秘魯魚粉飼料的對照組相比，蠅蛆粉組魚體增重率提高了20.8%，蛋白質效率提高了 16.4%。張洪玉等［4］研究表明，與配合飼料相比干蠅蛆可顯著提高中國對蝦的生長速度。本試驗投喂的3種等氮等能飼料中，添加25 g/kg蠅蛆粉飼料組可顯著提高青魚的增重率和特定生長率、降低飼料系數，這可能與蠅蛆中含有未知的促生長因子有關。Ajani等［10］和 Ogunji等［11］將蠅蛆粉部分或全部替代羅非魚(Oreochromis niloticus)飼料中的魚粉，對魚體的增重率、特定生長率、飼料系數和蛋白質效率均無顯著影響;陳乃松等［3］和曹俊明等［12］在凡納濱對蝦(L.vannamei)的相應研究中也得出了類似的結論。

對很多魚類而言，L－肉堿是一種促生長劑，參與機體的能量代謝，是脂肪酸進入線粒體進行β－氧化的載體，可促進脂肪的氧化供能，加快新陳代謝速度，提高飼料轉化率，節約蛋白質的消耗［13－14］;另外，添加外源的L－肉堿彌補了魚體合成肉堿的不足，減少了魚體內或飼料中賴氨酸和蛋氨酸的消耗，這被認為是L－肉堿促進生長的主要原因。研究表明，在飼料中添加適量L－肉堿可促進草魚［14］、奧尼羅非魚(Oreochromis niloticus× Oreochromis aureus)［15］和斑點鱸(Morone saxatilis♂ × M.chrysops♀)［16］的生長，提高了飼料效率。本試驗中，青魚攝食添加150 mg/kg L－肉堿的飼料后得到與上述報道一致的結果。但也有一些研究認為飼料中添加肉堿對魚類生長和飼料系數并無影響，如大西洋鮭(Salmo salar)［17］、非洲鯰(Clarias gariepinus)［18］和虹鱒 (Oncorhynchus mykiss)［19］等。這些結果表明，蠅蛆粉和L－肉堿對魚類生長的作用效果可能受多種因素影響，如品種、生長發育階段、飼料組成與營養水平等，表現出一定的差異性。

3.2 蠅蛆粉和L－肉堿對青魚免疫力和抗病力的影響

魚類血液成分的變化被廣泛地用來評價魚體的健康狀況、營養狀況以及對環境的適應狀況，是重要的生理、病理和毒理學指標［20］。溶菌酶是生物體內重要的非特異性免疫因子之一，它產生于嗜中性粒細胞和巨噬細胞，并被分泌到血液及黏液中發揮溶菌效應，研究表明機體溶菌酶活性提高，其免疫力也相應提高［21－22］。堿性磷酸酶(AKP)是一種重要的代謝調控酶，可通過改變病原體的表面結構而增強被侵襲機體對病原體的識別和吞噬能力［23］，有助于提高魚體的抗病力。補體是抵抗病原微生物感染的重要成分，在硬骨魚類中補體具有細胞溶解、細胞黏附、中和毒素、清除病原菌等重要的生物學效應［24－25］。補體C4參與補體經典途徑的激活過程，而補體C3在補體激活的經典途徑和替代途徑中都起作用［25］。本試驗中，蠅蛆粉可顯著提高青魚血清溶菌酶、AKP、補體 C3和 C4的活性(P ＜0.05)，從而增強魚體的非特異性免疫力。這與張洪玉等［4］和劉麗波等［26］有關蠅蛆可提高對蝦免疫力的報道相一致，可能與蠅蛆中含有抗菌肽、凝集素和溶菌酶等免疫活性物質有關［1－4］。曹俊明等［12］研究認為飼料中含適量蠅蛆粉可提高對蝦血清酚氧化酶活性，但對AKP的活性無影響，而陳乃松等［3］在飼料中以少量蠅蛆粉替代魚粉導致對蝦血清溶菌酶的活性下降。目前有關L－肉堿對魚類非特異性免疫力的影響還鮮見報道，本試驗中L－肉堿可顯著提高青魚血清溶菌酶、補體 C3和 C4的活性(P ＜0.05)，但對 AKP活性無顯著影響。這可能與L－肉堿具有免疫調節及免疫治療的作用有關［5－7］。

嗜水氣單胞菌的攻毒試驗也表明，蠅蛆粉和L－肉堿組青魚的死亡率均明顯低于對照組。由于大多數魚類特異性抗體的產生需要長期的適應并通過產生記憶而形成［27］，因此本試驗中青魚相對保護率的提高，可能與蠅蛆粉、L－肉堿提高了魚體溶菌酶、堿性磷酸酶、補體C3和C4以及SOD等非特異性免疫酶的活性有關［21－24，27］，從而增強了魚體的抗病力。

3.3 蠅蛆粉和L－肉堿對青魚抗氧化能力的影響

動物機體在新陳代謝的過程中，活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的產生和消除保持著動態平衡，過多的自由基會引起脂質過氧化反應，丙二醛(MDA)是脂質過氧化物的主要成分，具有很強的生物毒性，會破壞細胞的結構和功能［28］。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH－Px)和過氧化氫酶(CAT)等組成的抗氧化酶系統可清除過多的自由基，減少脂質的過氧化損傷［11，28－29］，其中SOD可特異性地催化超氧化物自由基歧化為過氧化氫和氧，過氧化氫在CAT和GSH－Px的作用下生成無毒性的水和氧;GSH－Px還可介導還原型谷胱甘肽催化脂質過氧化物分解成相應無毒性的醇。因此，檢測魚體血液和肝臟中SOD、GSH－Px、CAT和MDA的變化可較準確地反映機體內的抗氧化狀況。

本試驗中，蠅蛆粉可顯著提高青魚血清和肝臟中SOD、GSH－Px和CAT的活性，降低MDA的含量(P＜0.05)，這表明飼料中添加適量蠅蛆粉可增強魚體的抗氧化能力，保護機體免遭過氧化物的損傷。但也有研究認為蠅蛆粉對對蝦血清SOD［3，12］和羅非魚肝臟CAT［11］的活性無明顯影響。L－肉堿抗氧化功能主要表現在抑制ROS的產生、防止大分子氧化損傷和提高抗氧化酶類的活性及基因表達等［30－31］。目前，有關L－肉堿對魚類抗氧化能力的研究鮮見報道。本試驗中L－肉堿可不同程度地提高青魚血清與肝臟中SOD、GSH－Px和CAT的活性，降低MDA的含量，從而增強魚體的抗氧化能力。

4 結論

在飼料中添加蠅蛆粉25 g/kg或L－肉堿150 mg/kg可促進青魚的生長，提高魚體的非特異性免疫力和抗氧化能力，增強魚體抗病原菌的感染力，對防病抗病有一定的功效。

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